论文部分内容阅读
研究背景及目的：
目前有关肝纤维化进程的干预逆转是慢性肝病领域的研究热点。肝纤维化是指在各种致病因子如炎症、损伤、药物、遗传因素等的作用下，活化的成纤维细胞或肌成纤维细胞增多，细胞外基质大量沉积的病理改变。既往研究表明，活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)通过上皮细胞间质转型(EpitheliAltomesenchymAltransition，EMT)是产生细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的主要来源，并参与肝纤维化发生发展。EMT主要是指上皮细胞在形态、细胞结构、细胞功能以及细胞黏附、迁移能力等方面获得间质细胞特性的过程。苦参碱具有保护肝损伤，抗肝纤维化的作用。本研究课题组在前期的工作中通过竞争色谱法/连续亲和色谱法，得到了与苦参碱树脂特异结合的蛋白质。之后通过SDS-PAGE凝胶电泳和银染显示蛋白条带的方法从结合蛋白条带中鉴别出与苦参碱特异结合的蛋白质条带。随后又对苦参碱特异结合的蛋白条带进行质谱鉴定，推测其可能为核糖体蛋白S5（ribosomAlprotein S5，RPS5)。最后通过Western-blot的方法来验证了所推测蛋白的正确性。
核糖体蛋白S5是真核生物核糖体的重要组成部分，在蛋白质翻译方面起调控作用。人的RPS5基因全长701bp，编码204个氨基酸，在5’端非编码区有37个碱基，和编码区612个碱基相连，在3’端非编码区有一与Poly(A)尾相连的51bp的非编码序列。过去对RPS5的研究主要侧重于以下几方面:RPS5的晶体结构及其在核糖体结构上的分布特点；RPS5与蛋白质的翻译;RPS5具有DNA连接蛋白Ⅱ的功能；RPS5具有转录延伸因子3(EF-3)的功能。近年来，越来越多的证据表明，许多核糖体蛋白除组成核糖体，参与蛋白质的生物合成之外，也与许多严重疾病相关。目前，还没有将该蛋白作为抗肝纤维化药物的靶蛋白的研究报道。为了进一步研究RPS5在肝纤维化中的作用，本实验课题组分工合作，从各个角度侧面进行研究。
近年发现的细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)是一类具有细胞生物膜穿透功能的肽类物质，PEP-1是人工合成的穿透力强、效率高的穿膜肽，能够携带大分子物质进入细胞发挥生物学活性。PEP-1能将与其共价连接的多肽、蛋白质及DNA等分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞，具有较低毒性副作用，是一种很有前途的运载工具。
本课题的研究目的是构建融合PEP-1和人源RPSS基因的重组表达载体pET-28a-PEP-1-RPSS，将该重组载体转化表达菌后，表达纯化出带有PEP-1的RPS5重组蛋白，转入肝星状细胞中，观察RPS5是否影响肝星状细胞功能。同时构建表达载体pET-28a-RPS5，表达纯化出RPS5蛋白作为PEP-1-RPS5的阴性对照。以纯化的RPS5蛋白为分子靶蛋白建立抗肝纤维化药物的体外筛选模型。
实验方法：
1.应用PCR扩增人的HEK293细胞的RPS5基因片段，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定并切胶纯化后与pMD18-T载体连接，构建克隆质粒pMD18-T-RPS5，转化大肠杆菌DH5a，提取质粒，BamHI和XhoI双酶切鉴定正确后将割胶纯化后的RPS5目的片段连接至带有PEP-1穿膜肤的表达载体pET-28a，构建原核表达质粒pET-28a-PEP-1-RPS5，转化大肠杆菌DH5a，提取质粒，BamHI和XhoI双酶切鉴定及DNA测序正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白表达。同样的方法构建pET-28a-RPS5。
2.在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下，pET-28a-PEP-1-RPS5融合表达载体在大肠杆菌菌株BL-21(DE3)中表达PEP-1-RPS5蛋白，超声破碎细胞，SDS-PAGE电泳分析蛋白表达形式。溶解蛋白，在AKTA explorer100上通过HisTrap TM HP亲和层析柱初步纯化，然后经脱盐柱Hiprep TM Desalting脱盐，上离子交换柱DEAE Sepharose TM Fast Flow进一步纯化，Western Blot印迹试验鉴定。同样的方法进行RPS5的表达纯化及鉴定。
3.将纯化获得的重组蛋白PEP-1-RPS5或RPS5加入大鼠肝星状细胞HSC-T6中5h后裂解细胞提取细胞蛋白，Western Blot检测重组蛋白PEP-1-RPS5穿透细胞膜的能力以及对Ⅲ型胶原水平的影响。
4.采用SPR(Surface Plasma Resonance)技术，检测药物苦参碱(Matrine,Mat)、苦参碱衍生物(Mat-19, Mat-21)、木犀草素(Luteolin,Lut)与RPS5的结合活性。
实验结果：
1.通过以人胚肾细胞HEK293的cDNA为模板进行PCR，克隆出RPS5的目的片段，经pMD18-T-RPS5的桥梁作用，分别与带有PEP-1载体pET-28a和不带PEP-1的载体pET-28a连接，构建出重组表达质粒pET-28a-PEP-1-RPS5/pET-28a-RPS5。经BamHI和XhoI双酶切和序列测定证明目的片断止确;
2.将重组表达质粒pET-28a-PEP-1-RPS5/ pET-28a-RPS5转化入BL-21(DE3)表达菌中，表达菌经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳证明在30℃时，1mMol/L IPTG诱导9h的表达量最高，重组蛋白主要以包涵体形式高效表达，经Western Blot验证证明两目的蛋白表达止确。
3.用含8mol/L尿素的溶解缓冲液溶解包涵体，应用金属鳌合亲和层析法进行初步纯化，200mMol/L的咪唑洗脱得到较纯目的蛋白，再经脱盐柱脱盐后，用离子交换层析法进行精细纯化，得到单一条带纯蛋白，灰度扫描软件分析，PEP-1-RPS5纯度为92.7％，RPS5纯度为87％。
4.纯化后的PEP-1-RPS5/RPS5加入HSC-T6细胞共孵育，通过裂解细胞，获得细胞内总蛋白，Western Blot检测证明重组蛋白PEP-1-RPS5能够有效转入HSC-T6细胞内，并且能浓度依赖地降低细胞内Ⅲ型胶原的水平。
5.木犀草素与RPS5有一定程度的结合，呈现动力学曲线模式，而Mat、Mat-19、Mat-21与RPS5的结合较弱，表现为稳态结合模式。
结论：成功构建原核表达质粒pET-28a-PEP-1-RPS5/pET-28a-RPS5，在大肠杆菌中高效表达出重组蛋白PEP-1-RPS5/RPS5，建立重组蛋白纯化及体外重折叠复性方法。重组蛋白PEP-1-RPS5能成功转入HSC-T6细胞，并能降低细胞内Ⅲ型胶原的水平，提示RPS5可能是肝纤维化的治疗的新靶点，PEP-1-RPS5有望成为治疗肝纤维化的基因工程药物。