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霉酚酸(MPA)是器官移植临床的一线用药,越来越多的器官移植患者使用该药来对抗排斥反应,但常有患者因严重的胃肠道不良反应而减量或停药,这将会导致患者排斥反应发生率的增加。由于MPA的药代动力学过程非常复杂,可受多种因素影响而出现较大的个体差异,其中需要长期合用的环孢素(CsA)就会对MPA的体内过程产生较大的影响,从而影响其抗排斥反应的疗效发挥及毒性的增加,因此需要对其进行治疗药物监测(TDM),调整MPA的用药剂量以保证充足的疗效及良好的安全性,但由于不良反应机制不清、可监控性小等因为限制了其TDM的开展。本研究从MPA在大鼠体内的药代动力学特征及CsA的影响和胃肠道毒性的机制分析入手,拟为MPA的临床合理用药提供参考。主要研究内容如下:
1建立简单、高效的HPLC-UV方法同时测定大鼠血浆及胆汁中MPA及其代谢物MPAG和AcMPAG的浓度。分别采用简单高效的蛋白沉淀法和乙酸乙酯液-液萃取法提取血浆和胆汁中的三种待测物与内标。方法的专属性、线性范围、日内日间精密度、回收率和稳定性均符合生物样本的测定要求。
2 MPA及其代谢物在大鼠体内的药代动力学和胆汁分泌特征及CsA的干预研究。大鼠口服给予MMF(MPA的前药)后收集血样至36h,胆汁样品至9h,采用已建立的HPLC-UV方法检测样品中三种待测物的浓度。结果发现大鼠血浆中只能测到MPA及其主要代谢产物MPAG,而未测到另一种活性代谢产物AcMPAG；胆汁中可测到包括AcMPAG的三种待测物。MPA与MPAG在大鼠血浆的代谢特征均符合二室一级代谢动力学模型,MPA存在明显的多峰现象。临床对应剂量(90mg/kg)的药物口服后大鼠血浆MPA的主要药代动力学参数(统计矩计算法)如下:T1/2z为12.9±8.2h,Cmax为35.5±12.1 mg/L,AUC0-36h为352.2±128.7 mg·h/mL,CLZ/F为0.20±0.07 L/h/kg,VZ/F为3.6±1.3 L/kg；9h内三种待测物的胆汁排泄总量约占口服药物总量的34.36％,以MPA形式排泄的约0.08％,以MPAG和AcMPAG形式排泄的则分别为33.22％和1.06％。单用时不同剂量间的MPA-AUC0-36h及MPA-Cmax均呈良好的线性关系。合用CsA后这种线性关系受到影响,CsA能显著升高正常剂量MMF组(45-90mg/kg)的MPA清除率、降低MPA-AUC(P<0.05),而高于正常剂量MMF组(180mg/kg)的MPA清除率及MPA-AUC均不受CsA影响(P>0.05),表明CsA对MPA的药代动力学影响可能是个非线性的过程。
3采用NONMEM分析法建立MPA肝肠循环(EHC)的群体药代动力学(PPK)模型,分析CsA对MPA药代动力学个体差异的影响。结果发现MPA在大鼠体内的药代动力学特点与二房室模型拟合效果最好,另外还有一个EHC室,MPA自中央室排入EHC室的过程符合一级动力学,而由EHC室回吸收至中央室的过程则符合零级动力学,即为非线性过程。CsA与MPA清除率的个体间差异具有显著相关性,将CsA作为固定效应引入模型可显著降低模型的目标函数值(P<0.001),改善模型的拟合效果。经统计图解分析、bootstrap抽样法及浓度预测验证,最终模型的预测效果准确而稳定。利用最终模型模进行数据拟合,发现EHC可使MPA-AUC降低约40％,而CsA则可使MPA-AUC降低约51％。结果表明MPA的EHC是一个非线性的过程,可显著影响MPA的体内暴露量；CsA可通过抑制MPA的EHC导致MPA-AUC出现非线性的变化,是造成MPA药代动力学个体间差异的一个重要影响因素。
4连续服用MMF后大鼠的肠道反应及细胞因子表达。连续口服给予大鼠40mg/kg的MMF,分为MMF1W、2W、3W组和对照组,观察所致胃肠道反应,并用免疫组化方法检测大鼠肠粘膜与肠炎相关的各种细胞因子的表达情况。结果显示一周内即可出现腹泻、体重减轻等症状(与对照组相比,P<0.01或.P<0.05),持续一段时间后,随着用药时间的延长,这些症状会有所缓解(3W组出现体重增加,与1W组相比,P<0.01)。肠道组织学检查表明腹泻期和非腹泻期大鼠各肠段均可出现不同程度的炎症性改变,包括淋巴细胞浸润、肠细胞异型、肠粘膜及粘膜下层结构破坏等。细胞因子的表达主要在肠粘膜固有层以上部位,表达升高比较明显的细胞因子主要包括IL-1β、IL-6、IL-8(MMF1W、2W组与对照组相比,P<0.01或.P<0.05)和IL-10(所有MMF组与对照组相比,均为.P<0.01或P<0.05)。而对于一般慢性肠炎发生时常常升高的TNF-α、IFN-γ和中性粒细胞标记物MPO,本实验的2W与3W组均未观察到明显的阳性表达,只有1W组出现了IFN-γ和MPO的较高阳性表达(与对照组相比,P<0.05)。结果表明连续服用MMF可致大鼠发生肠道炎性改变,这种肠道反应主要由免疫因素参与,可能与肠道局部某些细胞因子的表达升高有关。
5霉酚酸及其代谢物对Caco-2细胞体外肠炎模型的作用研究。建立巨噬细胞RAW264.7与结肠癌细胞Caco-2的共培养系统,将脂多糖(LPS)加入底外层可引起RAW264.7细胞释放大量的细胞因子TNF-α、IL-1β(与对照组相比,P<0.001)及IL-6(与对照组相比,P<0.01),同时可测到共培养系统上层Caco-2细胞内IL-8 mRNA的表达水平升高(与对照组相比,P<0.05)及Caco-2细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的升高(与对照组相比,P<0.001),表明本实验所用细胞共培养系统可成功模拟体外肠炎模型。分别以MPA、MPAG和AcMPAG刺激底外层的RAW264.7细胞,观察其细胞因子的分泌情况(IL-8的mRNA表达)及共培养的Caco-2细胞损伤情况(LDH的分泌)。结果显示MPA的活性代谢产物AcMPAG能够刺激RAW264.7细胞大量分泌细胞因子IL-1β和IL-6(与对照组相比,P<0.01),5h内可引起Caco-2细胞内IL-8 mRNA的表达升高反应(与对照组相比,P<0.05),48h内可诱导Caco-2细胞的损伤,从而导致LDH的大量释放(与对照组相比,P<0.001)。而MPA与MPAG除了可引起LDH的释放量轻度增加(与对照组相比,P<0.05)之外未表现有其他作用,而且LDH的释放量显著低于AcMPAG组(P<0.01)。另外AcMPAG与MPA可增加Caco-2细胞内肠炎保护性物质SERT的mRNA.表达。结果表明MPA的活性代谢产物AcMPAG能够通过诱导一些细胞因子表达增加造成肠粘膜的炎症性改变,可能是引起MPA肠道毒性的物质,诱导保护性物质释放可能是肠炎症状可自行缓解的因为之一。
结论:①本研究建立了一种简单高效的同时测定MPA及其代谢产物MPAG与AcMPAG的HPLC-UV方法；②对MPA在大鼠体内的药代动力学及肝肠循环的特点进行了系统的研究,结果表明CsA可对MPA的体内暴露量产生明显的影响,提示临床合用时可能影响MPA的临床效果,可能需要实行MPA-TDM,为MPA的临床合理用药提供了一定的参考；③初步探明了MPA产生胃肠道毒性的机制可能是经胆汁排入肠道的AcMPAG通过诱导某些肠道炎症细胞因子的释放而引起,为临床对MPA胃肠道毒性的监测和预防提供了理论基础。