鸭病毒性肝炎主要由鸭肝炎Ⅰ型病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)引起,该病毒主要感染雏鸭,感染后传播迅速、发病快、致死率高,所以该病是鸭养殖业重点防御疾病之一。本课题通过化学修饰方法分别得到黄芪多糖磷酸化修饰衍生物(phosphorylation Asragalus polysaccharide,pAPS)和硫酸化修饰衍生物(sulfation Astragaluspolysaccharide,sAPS),并通过比较两种衍生物与黄芪多糖(Astragalus polysaccharide,APS)体外抗DHAV作用、临床治疗作用和免疫调节作用,比较研究多糖及其衍生物抗病毒作用差异,为研究抗鸭病毒性肝炎有效治疗药物奠定基础。研究内容主要分为以下几部分:试验Ⅰ:黄芪多糖提取及两种分子修饰物的制备本试验旨在提取黄芪多糖,并优化黄芪多糖磷酸化工艺,为后续试验准备试验药物。首先采用水煎醇沉法提取黄芪多糖,并通过三氯化碳除去蛋白质,经DEAE-52纤维柱纯化;纯化后的黄芪多糖分别用三偏磷酸钠-三聚磷酸钠法(STMP-STPP)和氯磺酸-吡啶法修饰得到pAPS和sAPS;修饰后的产物经红外分析验证,并同APS红外光谱图进行比较分析。试验结果显示纯化后的黄芪多糖多糖含量为74.86%;纯化后的多糖经正交优化磷酸化工艺,pH为8.5,反应时间为4h,反应温度为70℃时为最佳修饰条件,多糖含量为45.28%,磷酸根含量为40.31%。试验Ⅱ:黄芪多糖及其两种分子修饰物体外抗鸭肝炎病毒作用比较本试验旨在评价APS及两种修饰物pAPS和sAPS体外抗DHAV的效果。通过MTT法测定三种药物在鸭胚肝细胞(Duck embyro hepatocytes,DEHs)中的最大安全浓度,并测定APS、pAPS和sAPS三种不同加药方式各多糖的体外抗DHAV作用;通过RT-PCR方法测定三种药物在病毒增殖不同阶段抵御病毒增殖的效果。试验结果显示APS、pAPS和sAPS在DEHs中最大安全浓度分别为1250、625和15.625 μg.mL-1,在不同的加药方式试验中,三种多糖体外皆有抗DHAV感染鸭胚肝细胞的作用,且pAPS作用优于APS和sAPS;RT-PCR测定结果表明在病毒增殖过程中,APS及其分子修饰物主要抑制病毒复制和释放过程,且pAPS抑制效果最强。试验Ⅲ:黄芪多糖及其两种分子修饰物临床治疗作用比较本试验旨在比较研究APS、pAPS和sAPS体内抗DHAV感染雏鸭的效果。采用肌肉注射DHAV法攻毒,将攻毒雏鸭分为APS、pAPS、sAPS和VC组,并设BC组,药物组服用相应药物,观察各组雏鸭存活率、动态存活情况和病理解剖病变情况;攻毒后第4h、8h和96h动脉采肝损伤生化评价指标(ALT、AST、ALP、LDH、TP、ALB和GLO)和氧化损伤评价指标(MDA、NOS、GSH-Px和SOD);并通过RT-PCR监测攻毒后相应时间点全血中病毒相对表达量。试验结果发现,仅pAPS在体内试验中表现出较好的抗病毒作用,可显著降低雏鸭死亡羽数,显著减轻攻毒后机体肝损伤程度,在攻毒后第8h和第54h体内病毒相对含量显著降低,而APS和sAPS未表现出良好的治疗效果。试验Ⅳ:黄芪多糖及其两种分子修饰物体内外免疫调节作用比较本试验旨在比较APS、pAPS和sAPS药物体外对成年鸭免疫调节的作用。测定APS、pAPS和sAPS对成年鸭外周血淋巴细胞最大安全浓度,以及植物血凝素(phytohemagglutin phytolectin,PHA)和环孢菌素 A(cyclosporin A,CyA)最佳有效浓度后,通过淋巴分离液分离外周血淋巴细胞,设三个处理组分别为药物单独处理组、协同PHA作用组和拮抗CyA作用组,每组加入最大安全浓度的APS、pAPS和sAPS,并设相应对照组,用MTT法测定淋巴细胞增殖活性并收集上清,采用ELISA试剂盒测定上清中IL-2和IFN-y含量。体内试验运用ELISA试剂盒测定攻毒后雏鸭,给药后4h、8h和96h血清中IL-2和IFN-γ含量。试验结果显示体外三种处理方式下APS、pAPS和sAPS均能促进淋巴细胞的增殖,对IFN-y的释放有促进作用,以pAPS作用最明显。体内试验发现,给药后药物组IFN-y在第8h显著高于VC组,但攻毒后IL-2变化不明显。综合分析发现pAPS体外抗DHAV感染DEHs作用,临床治疗效果以及体内外增强免疫作用均优于APS和sAPS。