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【研究背景】胆囊癌是消化系统肿瘤中高度恶性程度的肿瘤,对于无法手术的病人目前尚无有效的治疗手段。细胞凋亡抑制因子1(ciap1)是凋亡抑制因子家族的重要一员,最初因其抑制凋亡的作用而命名,后来发现ciap1可通过其分子内的ring结构域泛素化多种蛋白以实现其调节增殖、迁移、自噬及免疫等多种生命活动的目的。迄今为止,多种文献报道ciap1高度表达于多种肿瘤,并与相应肿瘤的发生、发展及预后有关。本文主要阐述了ciap1在胆囊癌细胞中增殖、迁移及抗凋亡的作用并对其抗凋亡机制进行了初步探究,旨在为胆囊癌的治疗提供新的治疗思路。【方法】1.用免疫组化检测胆囊癌及癌旁组织ciap1的表达情况。2.用慢病毒沉默胆囊癌细胞株noz及sgc-996的ciap1表达,经嘌呤霉素筛选沉默的细胞株lv-shciap1,以转染随机对照序列慢病毒的细胞株nc为对照组。用cck-8试剂及克隆形成实验检测ciap1对胆囊癌细胞增殖的影响,利用transwell小室迁移实验检测ciap1对胆囊癌细胞迁移能力的影响。3.用放线菌酮、tnf-α和凋亡蛋白抑制剂z-vad分别或联合作用胆囊癌nc组及lv-shciap1组细胞,cck-8试剂检测细胞活力、用流式细胞术检测细胞凋亡情况、用western-blot检测各组中ciap1以及凋亡相关蛋白cleaved caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved parp的表达情况。4.利用免疫沉淀技术检测tnf-α联合放线菌酮刺激下nc组及lv-shciap1组中caspase-8与rip1相互作用的强弱。利用western-blot探究tnf-α刺激下nc组及lv-shciap1组中nf-κb亚单位p65蛋白核转移的情况,利用q-rtpcr及western-blot检测两组对应的c-flip转录及翻译水平。【结果】1、胆囊癌组织中ciap1的表达情况免疫组化检测32例胆囊癌组织及相应癌旁组织的ciap1蛋白表达,其中27例胆囊癌组织中ciap1表达呈中度及以上阳性,5例呈弱阳性或阴性;癌旁组织ciap1表达呈中度及以上8例、弱阳性或阴性24例。胆囊癌组织中ciap1的表达显著多于癌旁组织(χ~2=22.76,p<0.001)。2、ciap1对胆囊癌细胞株的增殖及迁移能力的影响cck-8增殖实验提示noz中lv-shciap1组的增殖能力低于nc组,72小时的od值显著低于后者(p<0.01);sgc-996中lv-shciap1组的增殖能力低于nc组,72小时od值也显著低于后者(p<0.05)。克隆形成实验中,noz的nc组所形成的细胞克隆计数显著多于lv-shciap1组(411.2±24.2 vs326.6±17.6,p<0.001);sgc-996的nc组形成的细胞克隆计数显著多于lv-shciap1组(481.0±31.4 vs 225.3±4.2,p<0.01)。transwell迁移实验中,noz中lv-shciap1组的穿膜细胞计数显著低于nc组(34.0±3.3 vs 63.6±4.8,p<0.001);sgc-996中nc组的穿膜细胞计数显著多于lv-shciap1组(77.4±7.22vs 122.6±8.24,p<0.01)。lv-shciap1组的增殖、迁移能力均低于nc组。ciap1具有促进胆囊癌细胞株的增殖及迁移的作用。3、ciap1对tnf-α介导的细胞凋亡的影响对比放线菌酮组,tnf-α+放线菌酮组中noz的细胞活力显著降低(p<0.001),其中lv-shciap1组细胞活力明显低于nc组(p<0.01);在sgc-996中,tnf-α+放线菌酮组的细胞活性对比放线菌酮组发生显著下降(p<0.001),并且在lv-shciap1组细胞活力明显低于nc组(p<0.001)。在两株细胞中,凋亡蛋白抑制剂z-vad可恢复tnf-α+放线菌酮所降低的细胞活性(对比放线菌酮组,noz组p=0.111;sgc-996组p=0.522)。流式细胞术检测发现在tnf-α+放线菌酮组中,noz及sgc-996中lv-shciap1组凋亡细胞比例对比nc组显著增加(p均小于0.05)。与上述结果一致的是,western-blot显示在tnf-α+放线菌酮组中,lv-shciap1组相比nc组出现更多cleaved caspase-8、cleaved caspase-3及cleaved parp的活化(p均小于0.05)。在放线菌酮的作用下,沉默ciap1可促进tnf-α引起的caspase-8相关的凋亡级联反应。4、ciap1可促进nf-κb通路的激活及c-flip的转录及翻译免疫共沉淀结果提示在tnf-α+放线菌酮刺激下lv-shciap1并未形成更多的以caspase-8与rip1相互作用为主导的凋亡复合体Ⅱ(noz、sgc-996中p均大于0.05)。在tnf-α的作用下,noz中lv-shciap1组的cflar基因转录水平显著低于nc组(p<0.05);sgc-996中lv-shciap1组的cflar基因转录水平显著低于nc组(p<0.01)。在tnf-α的作用下,对比nc组noz的lv-shciap1组的c-flip蛋白翻译显著减少(p<0.001);sgc-996中c-flip蛋白翻译相对于nc组显著减少(p<0.05)。在tnf-α的作用下,noz中lv-shciap1组相比于nc组其nf-κb亚单位p-65胞质-胞核转移的量发生显著降低(p<0.05);sgc-996中lv-shciap1组相比于nc组p-65胞质-胞核转移的量也发生显著降低(p<0.05)。总之,ciap1可能通过nf-κb通路的激活及通路下游的抗凋亡蛋白c-flip的转录及翻译起抗凋亡的作用。【结论】1.ciap1在胆囊癌组织中的表达显著高于癌旁组织。2.ciap1可促进胆囊癌细胞的增殖及迁移。3.ciap1可抑制tnf-α诱导的caspase-8相关的凋亡。4.胆囊癌细胞中ciap1的抗凋亡的作用与nf-κb通路及c-flip表达相关。