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我们早期研究发现锰暴露大鼠可诱导中枢神经细胞发生坏死,进而在神经母细胞瘤细胞株(SK-N-SH细胞)锰暴露的体外培养细胞模型中,我们发现坏死样凋亡特异性阻滞剂Nec-1的干预可降低锰暴露致SK-N-SH细胞的坏死发生率,提示坏死样凋亡的调控机制可能参与了锰暴露诱导的神经细胞死亡。新近的研究报导了RIP3抑制剂的发现,包括GSK’840、GSK’843和GSK’872,为RIP3诱导的坏死样凋亡在锰致中枢神经系统损伤中的作用机制提供更多的有效证据,研究拟通过大鼠体内实验,进一步描述锰暴露大鼠中枢神经内坏死细胞的超微形态,并应用GSK’872干预锰致大鼠中枢神经系统损伤作用,探讨RIP3抑制剂GSK’872干预对锰致大鼠中枢神经系统损伤作用的影响及机制。目的研究亚急性锰暴露大鼠海马坏死神经细胞的超微结构变化特点;研究RIP3抑制剂GSK’872在亚急性锰暴露致大鼠神经元死亡中的作用机制。方法(1)将36只SD大鼠进行染锰建立亚急性锰暴露模型。动物随机分为2组,正常组和染锰组,每组18只。染锰组大鼠每日腹腔注射(iP)二氯化锰(15mg/kg,每周5天,连续4周)。同时在正常组的其它动物组给予腹腔注射等量生理盐水与染锰组进行实验阴性对照。染锰实验与对照实验结束后继续饲养动物两周。取2%多聚甲醛、2.5%戊二醛混合固定液在动物体内进行灌注固定,取双侧海马组织,按常规方法制作透射电镜超薄切片,于日立7650型透射电镜下观察大鼠海马CA1区超微结构变化并拍照。(2)将SD大鼠72只随机分为对照组、GSK’872对照组、染锰组和GSK’872干预组。染锰组和GSK’872干预组使用腹腔注射锰溶液法建立亚急性锰中毒模型(15mg/kg,5天/周,共4周),药物干预组在染锰后第二周经小脑延髓池注射GSK’872溶液(25mmol/L,10μL/次,1次/周,共3周),同时其他动物组给予同等剂量生理盐水注射到小脑延髓池,染锰及干预时间结束后继续饲养动物两周;(3)大鼠经灌注固定后,进行免疫组织化学法观察TH(Tyrosine hydroxylase,黑质酪氨酸羟化酶)阳性细胞和皮层与海马CA1区胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)阳性细胞表达的变化。(4)大鼠经颈椎脱臼法处死动物,各取皮层、海马和黑质组织,免疫蛋白印迹法检测皮层、海马GFAP、RIP3蛋白表达变化,黑质TH蛋白表达变化。PCR荧光定量法检测皮层、海马和黑质组织RIP1、RIP3、MLKL、NOX1和NOX4基因的表达。结果(1)锰暴露大鼠海马坏死神经元具有坏死样凋亡细胞的超微形态特征,主要表现为细胞胞体膨胀透明,细胞器较稀疏,胞核内的染色质浓缩、向细胞核膜边集,最终细胞核膜溶解,线粒体嵴间隙变宽、崩解,这些细胞的超微形态与凋亡神经元有明显区别。(2)与对照组比较,染锰组大鼠GFAP阳性细胞数明显增多,与其余各组比较有显著性差异;染锰组大鼠黑质TH阳性细胞无明显差异。GSK’872可以减少锰暴露大鼠GFAP阳性细胞数;GSK’872对增加锰暴露大鼠黑质TH阳性细胞数无明显影响,两组比较无统计学差异(P<0.05)。(3)与对照组比较,染锰组大鼠RIP3、NOX1、NOX4、MLKL基因呈高表达(P<0.05);与染锰组比较,GSK’872干预组大鼠RIP3、NOX1、NOX4、MLKL基因表达显著降低,组间差异有统计学意义(P<0.05)。(4)与对照组比较,染锰大鼠GFAP、RIP3蛋白表达水平均升高(P<0.05);染锰大鼠黑质TH达水平降低,GSK’872干预组海马、皮层GFAP、RIP3蛋白表达水平均降低(P<0.05);黑质TH蛋白达水平升高,组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论锰暴露大鼠海马坏死神经元具有坏死样凋亡细胞的超微形态特征。坏死性凋亡信号通路参与了锰暴露诱导了细胞发生坏死。GSK’872可通过拮抗神经元坏死样凋亡的发生、下调星形胶质细胞的活化水平,降低小胶质细胞炎症水平拮抗锰的神经毒性。