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背景：心肌梗死是严重危害人类健康的疾病之一,心肌梗死后的新血管生成对改善心肌血流灌注,挽救濒死心肌,促进心功能恢复十分重要。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是一类来源于骨髓的内皮前体细胞,在体内和体外均能分化为内皮细胞,参与了出生后生理和病理状态下的新血管生成。EPCs对于维持机体血管内皮系统的稳定、促进缺血组织新血管生成以及促进损伤血管内皮修复均具有重要的意义。当机体发生组织缺血或血管损伤时,从骨髓动员进入外周血的EPCs或者移植的EPCs能够在某些趋化因子和粘附分子的作用下,自发的向组织缺血或内皮损伤的部位募集,参与新血管形成和内皮修复,这一过程称为EPCs的归巢。EPCs的归巢特性对于EPCs的在治疗学上的应用具有十分重要的意义,而EPCs归巢的能力和数量则直接影响到EPCs的治疗效果。EPCs的归巢是一个复杂的过程,包括趋化、迁移、粘附、侵袭等多个环节,趋化和迁移是EPCs向组织缺血和血管损伤部位归巢的先决条件和关键因素。基质细胞衍生因子(Stromal cell-derived factor-1, SDF-1)是CXC家族的一种趋化因子,通过与其特异性受体CXCR4的相互作用,介导了造血干细胞和多种炎性细胞的趋化迁移。组织缺血时,SDF-1的表达明显升高,而外周血分离培养的EPCs表面可以检测到SDF-1的受体CXCR4的表达。然而,SDF-1与CXCR4在心肌梗死后EPCs归巢中的具体作用及下游的分子机制目前并不清楚。PI3K/Akt是SDF-1下游的重要信号传导通路,PI3K/Akt的激活,介导了包括内皮细胞在内的多种细胞的趋化和迁移。因此,研究SDF-1/CXCR4轴及其下游的信号传导通路PI3K/Akt在心肌梗死后EPCs归巢中的作用,可能为EPCs在心肌梗死治疗中的应用提供理论依据和新的思路。目的：体外培养扩增大鼠骨髓来源的EPCs,静脉移植EPCs,观察移植的EPCs在心肌梗死局部归巢的情况及其对心肌梗死的治疗作用。分别在体内和体外研究SDF-1/CXCR4轴及其下游的信号传导通路PI3K/Akt在EPCs趋化转移和心肌梗死后EPCs归巢中的作用。方法：密度梯度离心法分离大鼠骨髓单个核细胞,以1×105n/ml密度接种于5%血清浓度的EBM-2+SingelQuotes培养基中。倒置相差显微镜观察不同培养时间细胞生长形态变化,免疫组化法检测von Willebrand因子(vWF)以及内皮型-氧化氮合酶(eNOS)的表达,共聚焦荧光显微镜检测细胞摄取DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)以及结合FITC标记BS-1凝集素(Fitc-BS-1 lectin)情况,计算培养细胞的vWF和eNOS阳性率以及DiI和FITC双阳性率。使用表达EGFP的腺病毒转染EPCs进行细胞标记。在制备大鼠心肌梗死模型后24小时,将5×106n/ml密度的EPCs悬液1ml通过尾静脉注入心肌梗死大鼠体内,对照组给予不含细胞的1ml培养基静脉注射。分别在细胞移植后的14天和28天处死大鼠,荧光显微镜下观察EGFP标记的EPCs的归巢情况,vWF免疫荧光染色检测各组血管密度,血流动力学和心脏超声检测各组的心功能指标。流式细胞仪检测EPCs表面SDF-1的受体CXCR4的表达。使用SDF-1α干预体外培养的EPCs, Western blotting检测SDF-1α干预后EPCs磷酸化Akt和总Akt的表达。使用Transwell小室检测不同浓度SDF-1α对EPCs的趋化作用。分别使用CXCR4的特异性阻断剂AMD3100(10gg/ml)和PI3K/Akt的特异性阻断剂LY294002(20mM)处理EPCs,检测阻断CXCR4和PI3K/Akt对SDF-1α诱导的EPCs迁移的影响。建立大鼠急性心肌梗死模型,Elisa法检测心肌梗死后0.5d,1d,3d,7d时心梗局部和血清SDF-1的表达水平。使用CXCR4的特异性阻断剂AMD3100和P13K/Akt的特异性阻断剂LY294002处理EPCs。在心肌梗死后24小时,将悬浮于1ml培养基中的5×106个预处理或未处理的EPCs通过尾静脉移植到大鼠的体内,对照组给予不含细胞的培养基1ml静脉注射。分别在14天和28天时处死动物,检测各组EPCs的归巢情况和血管密度,颈动脉插管和心脏超声检测心功能指标,TTC染色检测各组心肌梗死面积。结果：体外培养的骨髓单个核细胞在培养第3天时观察到,部分贴壁细胞形成椭圆形或泪滴形结构；培养第5天时观察到细胞成明显的克隆样生长；培养第7天时大部分细胞变成梭形,且首尾相连,形成管腔样结构；培养第10天细胞基本长满培养皿底并可进行传代。免疫组织化学染色显示,培养细胞表达vWF阳性率为(91.64±3.12)%,表达eNOS阳性率为(89.68±3.47)%,DiI-acLDL和FITC-BS-1lectin双阳性率为(90.61±3.73)%。心肌梗死大鼠静脉移植EPCs后,梗死周边区可见EGFP阳性细胞,并形成管腔样结构,vWF因子染色证实为移植细胞归巢到心梗周边区形成的新生血管。EPCs移植后14天时EPCs治疗组血管密度为(14.36±1.48)n/mm2明显高于对照组的(6.33±0.69)n/mm2；细胞移植后第28天时,EPCs治疗组大鼠各项心功能指标均明显优于对照组,心肌梗死面积低于对照组。流式细胞仪检测显示体外培养的EPCs表达CXCR4阳性率为(52.06±2.10)%。SDF-1α诱导的EPCs的迁移为剂量依赖性,100ng/ml浓度SDF-1α诱导的EPCs迁移数量为(188.13±15.49)个/100倍视野。使用SDF-1α干预EPCs30分钟后,EPCs表达磷酸化Akt明显升高。使用AMD3100和LY294002预处理EPCs后,SDF-1α引起的Akt磷酸化和SDF-1α诱导的EPCs迁移均受到明显的抑制。Elisa检测显示心肌梗死后12小时梗死心肌和血清中SDF-1即升高,心肌梗死后24小时升高最明显,而后逐渐回落。静脉移植AMD3100或LY294002预处理的EPCs后14天时,AMD3100或LY294002预处理的EPCs组心肌梗死周边区血管密度明显低于EPCs移植组,心肌梗死周边区的EGFP阳性管腔密度也明显低于未处理的EPCs移植组。EPCs移植后28天,AMD3100或LY294002预处理的EPCs组各项心功能指标均较未处理的EPCs移植组差,且心肌梗死面积高于未处理的EPCs移植组。结论：使用EBM-2+SingelQuotes培养基培养密度梯度离心法分离的骨髓单个核细胞,可以得到较高纯度的EPCs。体外培养的EPCs有较强的增殖能力,表达多种内皮细胞表面标志。大鼠心肌梗死后,静脉移植的EPCs能有效的向心肌梗死周边区归巢,形成新生血管,减少心肌梗死面积,促进心功能的恢复。在原代培养的EPCs表面可检测到SDF-1的受体CXCR4的大量表达,PI3K/Akt信号传导通路的活化在SDF-1引起的EPCs迁移中发挥了重要的作用。SDF-1在心肌梗死后梗死及梗死周边区心肌和血清中的表达均明显升高。SDF-1/CXCR4轴介导的PI3K/Akt信号传导通路在心肌梗死后EPCs的归巢中发挥了重要的作用。