【背景】类风湿关节炎（RA）是高度致残性疾病,药物联合治疗仍是主要方法,而目前国际上常用的联合方案尚未达到令人满意的疗效,探索新的有效联合方案具有重要的现实意义。我们借鉴联合化疗治疗白血病的成功经验,根据细胞动力学原理,在国内外首次联合细胞周期特异性药物（MTX）与周期非特异性药物（CTX）小剂量按周期间歇给药治疗RA,经过10年的临床实践,取得了显著疗效,临床缓解率高,明显降低了副作用。为了从临床实践上升到理论认识的高度,本课题开展了RA动物模型的实验研究,以阐明其联合用药机制。经联机检索国内外尚未见有类似报道,为RA的治疗提供新思路和方法。【目的】通过对RA动物模型大鼠胶原诱导性关节炎（CIA）的实验研究,从炎性细胞因子、滑膜细胞凋亡与细胞周期蛋白角度,研究周期联合免疫抑制剂甲氨蝶呤（MTX）和环磷酰胺（CTX）的协同效应和作用机制。【方法】建立Ⅱ型胶原诱导的雌性Wistar大鼠CIA模型,随机分为正常对照组、CIA模型对照组、小剂量MTX治疗组(0.9mg.kg^-1.w^-1)、大剂量MTX治疗组(2.7 mg.kg^-1.w^-1)、小剂量CTX间歇治疗组(24mg.kg^-1.3w^-1)、联合治疗组(MTX:0.9mg.kg^-1.w^-1+CTX:24mg.kg^-1.3w^-1)。进行24周体内实验,初次免疫后3周开始给药。治疗过程中连续对大鼠的关节炎症程度进行评分,容积法（排水法）测量双后肢的足肿胀度。治疗21周后全部动物处死取材,再经固定、脱钙、包埋,制成切片。然后各组大鼠行HE染色观察踝关节滑膜的组织病理学改变,进一步通过:a.酶联免疫吸附方法（ELISA）测定血清TNF-α、IL-1的水平;b.TUNEL法检测滑膜细胞凋亡,免疫组织化学法检测突变型p53;c.滑膜细胞周期蛋白cyclin D1通过免疫组织化学法检测,原位杂交法检测eyelin D1mRNA水平。【结果】1.CIA大鼠造模成功率达83.3%（75/90）。症状、影像学、病理评估证实造模成功,为慢性关节炎,可维持24周。2.关节炎指数（AI）:各治疗组AI均较模型组明显改善,联合治疗组优于小剂量MTX、CTX组（P＜0.0 5）,与大剂量MTX组相近（P＞0.0 5）;联合治疗组足肿胀度改善程度最明显（P＜0.05）。3.HE关节病理改变:CIA模型组大鼠的滑膜层次增多,可达6-8层,甚至10余层,排列紊乱,大量炎性细胞浸润,软骨、骨组织严重侵蚀;小剂量MTX、CTX治疗组滑膜炎症、软骨及骨组织侵蚀有所减轻;联合治疗组和大剂量MTX治疗组滑膜炎症、软骨及骨组织侵蚀明显改善。4.血清TNF-α、IL-1水平在CIA模型组增高（P＜0.05）,CIA模型组6周和24周TNF-α水平均比正常对照组增高,CIA模型组24周TNF-α水平高于6周（P＜0.05）。联合治疗组抑制TNF-α与IL-1优于小剂量MTX、CTX组（P＜0.05）,与大剂量MTX组接近（P＞0.05）。5.滑膜细胞凋亡:（1）各治疗组滑膜细胞凋亡均较CIA模型组增加,联合治疗组凋亡程度最高,各组间平均灰度值差异有统计学意义（P＜0.05）。（2）突变型p53在CIA组表达上调（P＜0.05）,联合治疗组下调突变型p53优于小剂量MTX、CTX组（P＜0.05）,与大剂量MTX组相当（P＞0.05）。（3）经析因设计方差分析,滑膜细胞凋亡和突变型p53平均灰度值显示MTX与CTX有交互作用（P＜0.05）,联合治疗组优于单用药小剂量治疗组（P＜0.05）,提示MTX和CTX联合治疗为协同效应。6.滑膜细胞周期蛋白:免疫组化法检测各组滑膜组织cyclin D1呈阴性表达。原位杂交检测CIA模型组大鼠关节滑膜组织的cyclin D1 mRNA的阳性染色强度明显高于正常对照组（P＜0.05）,各治疗组滑膜cyclin D1 mRNA下调,联合治疗组cyclin D1mRNA表达最低,各组间平均灰度值差异有统计学意义（P＜0.05）。MTX与CTX有交互作用（P＜0.05）,联合治疗组优于单用药治疗组,提示MTX和CTX联合治疗为协同效应。【结论】1.在CIA大鼠模型中:血清TNF-α、IL-1水平异常增高;突变型p53表达上调;滑膜cyclin D1mRNA表达上调,导致滑膜异常增殖。2.联合治疗组在改善关节炎症状、改善滑膜病理改变,抑制血清TNF-α、IL-1水平,诱导滑膜细胞凋亡及下调突变型p53表达,下调滑膜cyclin D1 mRNA表达,均优于小剂量MTX、CTX治疗组。3.MTX和CTX存在药物交互作用,提示MTX和CTX周期联合治疗为协同效应。