【摘 要】
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目的研究miR-1271-5p在肿瘤以及肝癌中的作用,确定miR-1271-5p是否通过靶向肝细胞癌(HCC)中的细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)来抑制细胞增殖并增强放射敏感性。探讨miR-1271-5p靶向AVIL在HCC细胞增殖,侵袭,迁移以及Wnt/β-catenin/EMT信号通路中的作用。方法通过生物信息学分析miR-1271-5p与肿瘤及肝癌的相关性。采用定量逆转录聚合酶链反应(R
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目的研究miR-1271-5p在肿瘤以及肝癌中的作用,确定miR-1271-5p是否通过靶向肝细胞癌(HCC)中的细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)来抑制细胞增殖并增强放射敏感性。探讨miR-1271-5p靶向AVIL在HCC细胞增殖,侵袭,迁移以及Wnt/β-catenin/EMT信号通路中的作用。方法通过生物信息学分析miR-1271-5p与肿瘤及肝癌的相关性。采用定量逆转录聚合酶链反应(RT-q PCR)检测miR-1271-5p在HCC细胞中的表达水平,蛋白质印迹分析检测HCC细胞系和裸鼠移植瘤中CDK1的表达水平,运用生物信息学分析预测miR-1271-5p的某些潜在靶基因,利用双重荧光素酶报告实验确定miR-1271-5p与CDK1之间的直接关系,通过慢病毒过表达miR-1271-5p转染肝癌细胞以获得稳定的Lv-miR-1271-5p肝癌细胞,采用细胞计数试剂盒8(CCK8)、平板克隆、流式细胞术等实验技术分别评估细胞增殖、细胞周期和放射敏感性,通过动物实验进一步在体内验证肿瘤的放射敏感性。通过生物信息学分析癌基因组图谱(TCGA)中肝癌病人中AVIL的表达情况,采用q RT-PCR检测不同HCC细胞系中AVIL的表达水平,平板克隆和RTCA检测肝癌细胞增殖,流式细胞数检测细胞凋亡,划痕实验和RTCA检测肝癌细胞的迁移和侵袭,通过动物实验进一步检测体内肿瘤生长速度及转移情况,并通过western blot和免疫组化检测advillin蛋白、Wnt/β-catenin/EMT相关蛋白及原癌基因c-myc蛋白的表达情况,利用双重荧光素酶报告实验确定miR-1271-5p与AVIL之间的直接关系,结果miR-1271-5p在多种肿瘤特别是肝癌中表达降低,在肝癌发生发展中起重要作用,可能与miR-1271-5p对应PPI网络中的核心蛋白质FKBP1A的调控有关。HCC细胞系中miR-1271-5p表达水平显著低于正常人肝细胞系中的表达水平,生物信息学分析表明CDK1是miR-1271-5p的潜在靶标,双重萤光素酶报告实验证实CDK1是miR-1271-5p的直接靶基因;随着miR-1271-5p在SMMC-7721和Hu H-7细胞中的过表达,细胞增殖减少,放射敏感性增强,细胞周期分布改变,裸鼠移植瘤的生长明显减少,Mi R-1271-5p的过表达增强了放射敏感性,而CDK1的过表达会部分逆转过表达miR-1271-5p的生物学现象;接受放疗的肝癌病人中CDK1高表达者的生存预后差。在TCGA数据库中发现AVIL在肝癌组织中的表达明显高于正常人,HCC细胞系中AVIL表达水平显著高于正常人肝细胞系中的表达水平,沉默AVIL可以显著降低HCC细胞中AVIL的表达、增殖和克隆形成能力,而凋亡率则显著提高,并且沉默的AVIL细胞的迁移和侵袭能力降低;在体内,SMMC-7721细胞中的AVIL沉默也可以抑制肿瘤生长,体内研究还表明沉默AVIL减少了HCC细胞的远处转移;沉默AVIL基因可以上调HCC细胞,裸鼠移植瘤和裸鼠肺转移瘤中的E-cadherin蛋白表达,而advillin、β-catenin、N-cadherin和C-myc蛋白表达被下调,在体内外有效抑制肝癌细胞中的Wnt/β-catenin/EMT通路蛋白表达及原癌基因c-myc的蛋白表达。生物信息学分析表明AVIL是miR-1271-5p的潜在靶标,双重萤光素酶报告实验证实AVIL是miR-1271-5p的直接靶基因。结论miR-1271-5p在肿瘤尤其肝癌的发生发展过程起到重要作用。miR-1271-5p通过靶向CDK1抑制HCC细胞增殖并增强肝癌的放射敏感性。AVIL是miR-1271-5p的直接靶基因,沉默AVIL可以在体内外降低肝癌的增殖,侵袭,迁移以及Wnt/β-catenin/EMT通路蛋白表达及原癌基因c-myc的蛋白表达。
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