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骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是一种多能干细胞,在胚胎发育时期由中胚层间充质分化而来。MSCs具有分化为包括骨细胞、肌纤维细胞等多种组织细胞的潜能。近年研究证明,骨髓间充质干细胞还具有很强的抗肝纤维化作用,能够在试验动物受损伤的肝脏内转化成为肝卵圆细胞(hepatic oval cells, HOCs)并进一步分化为有功能的肝细胞和胆管细胞,而且这种现象在接受过骨髓移植或肝移植的患者体内也同样存在。大量的科学研究证明无论体外诱导还是体内移植,均可使骨髓间充质干细胞分化为有活性的肝细胞,从而参与肝脏损伤的修复,达到减轻肝纤维化、预防肝硬化的目的。动物实验证实MSCs移植能明显减少肝组织内胶原沉积和羟脯氨酸的含量,抑制肝细胞内α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,降低血清中Ⅲ型前胶原、丙氨酸氨基转氨酶、透明质酸和层粘连蛋白等肝纤维化指标的水平。移植的方式包括同种异体移植和异体异种移植,采用的模型动物大部分为大鼠和小鼠。骨髓间充质干细胞移植为肝炎、肝纤维化的治疗带来了新的途径。骨髓间充质干细胞可分泌多种细胞因子,这些细胞因子能刺激肝细胞增殖,抑制肝星形细胞的激活。骨髓间充质干细胞还可以通过分泌基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMPs)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase—type plasminogen activator, uPA)来加速细胞外基质的降解,减少胶原纤维的沉积。骨髓间充质干细胞在肝纤维化动物模型肝脏中的种植率远远高于其他肝损伤动物模型及正常动物,但分化为功能肝细胞的比例较小。因此骨髓间充质干细胞体内分化为功能肝细胞,可能仅是移植骨髓间充质干细胞治疗肝纤维化众多作用机制之一肝纤维化动物模型的肝脏修复可分为两种,内源性修复和外源性修复。肝组织内存在肝卵圆细胞(hepatic oval cells, HOCs),是可分化为功能肝细胞的肝干细胞,负责肝细胞的生理性更新,在病理情况下也可以参与肝损伤的修复,这种修复是肝损伤修复中的内源性修复。骨髓间充质干细胞移植入肝纤维化动物模型体内后,定向迁移至肝脏,在肝脏分化为功能肝细胞参与肝组织的修复,这是肝损伤修复中的外源性修复。骨髓间充质干细胞在肝纤维化动物模型体内不仅可以分化为功能肝细胞,还可以分化为肝卵圆细胞,表明骨髓间充质干细胞移植治疗肝纤维化可通过内源性和外源性两种修复途径起作用。本实验采用整体和离体两种实验方法,将骨髓间充质干细胞回输至肝纤维化模型大鼠体内,通过针刺的干预方式来探索可能影响骨髓间充质干细胞在大鼠体内定向迁移及分化的因素。目的：1选取肝脏作为目标器官,从酒精性肝纤维化动物模型入手,通过细胞回输的方法将CM-Dil染料标记的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)移植入肝纤维化模型大鼠体内,观察针刺对骨髓间充质干细胞在肝纤维化模型大鼠体内趋向迁移分化的影响,探讨针刺治疗肝纤维化的细胞学机制。2体外培养骨髓间充质干细胞,并加入干预措施诱导其向肝细胞分化。方法：1采用全骨髓细胞贴壁法分离培养提纯MSCs,免疫细胞化学方法鉴定所分离培养细胞CD44、CD71、CD34的表达。2将大鼠随机分为正常对照组、肝纤维化模型组、穴位针刺组、筋膜针刺组,其中肝纤维化模型组、穴位针刺组、筋膜针刺组均每日灌胃白酒—玉米油—吡唑混合液建立酒精性肝纤维化动物模型,正常对照组每日灌胃等量的自来水。穴位针刺组隔日对大鼠的期门穴和阳陵泉穴进行针刺干预,筋膜针刺组隔日对位于大鼠期门穴和阳陵泉穴旁的筋膜密集区域进行针刺干预,两组均采用平补平泻法行针,留针30min,针刺从第一周造模开始至第二十周造模结束。3 CM-Di1红色荧光染料标记骨髓间充质干细胞,荧光显微镜下观察标记率。骨髓间充质干细胞被成功标记后,将其经尾静脉回输至各模型组大鼠体内。4造模及针刺干预结束后,10%水合氯醛麻醉,取各组大鼠肝组织并腹主动脉取血液。肝组织进行冰冻切片,普通显微镜下观察肝脏形态结构,荧光显微镜下观察标记细胞的表达率；血液离心后取血清,-70℃保存备用。5将各组大鼠血清分别加入细胞培养基中,体外培养骨髓间充质干细胞。观察各组大鼠血清对骨髓间充质干细胞体外增殖分化的影响。结果：1所分离培养的细胞可表达骨髓间充质干细胞表面抗原CD44、CD71,不表达造血谱系的CD34。2肝纤维化血清学指标和HE染色均显示成功建立肝纤维化大鼠模型。3骨髓间充质干细胞荧光标记48h后CM-Dil在红色荧光的激发下发出红光,细胞膜质可见红色荧光,细胞轮廓清晰。4大鼠肝组织冰冻切片于荧光显微镜下可见表达红色荧光的标记细胞,其中正常对照组大鼠肝组织未见标记细胞,肝纤维化模型组大鼠肝组织可见少量标记细胞,穴位针刺组和筋膜针刺组大鼠肝组织标记细胞数量明显比肝纤维化模型组增多,标记细胞呈圆形或长梭形,呈散在分布。5除正常对照组外,其余各组大鼠血清干预体外培养的骨髓间充质干细胞后,骨髓间充质干细胞表现为肝细胞样形态,并表达白蛋白。结论：1本次实验成功分离和培养了大鼠骨髓间充质干细胞,并复制了酒精性肝纤维化大鼠模型。2成功实施了骨髓间充质干细胞的CM-Dil标记及体内回输示踪。3针刺穴位和筋膜可以促进骨髓间充质干细胞回输后向肝纤维化模型大鼠受损伤的肝脏迁移。4肝纤维化模型大鼠的血清可体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化,其诱导作用大于正常对照组。5针刺干预骨髓间充质干细胞治疗肝纤维化的细胞学机制可能与针灸能改变骨髓间充质干细胞所处微环境有关。