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研究背景与目的:近年来由于遗传因素、生存环境、饮食结构以及生活方式等相关因素的影响,男性生育能力明显下降。男性不育不但已经成为影响人类生殖健康的重大疾病,而且在一定程度上破坏了社会的和谐与稳定。因此阐明精子发生和男性不育发病机制已经成为亟待解决的问题。在前期的研究中,我们通过家系连锁分析以及全外显子组测序等一系列遗传分析手段,发现在一个特发性促性腺激素低下性性腺功能减退症(idiopathic hypogonadotropic hypogonadism,IHH)患者家系中存在与piRNA生成通路相关基因MOV10L1的突变。诸多动物实验研究也已表明,piRNA生成障碍会影响雄性配子的形成,同时也有学者发现piRNA在神经元细胞中也有表达,从而推测MOV10L1基因突变可能与IHH发生有关。本研究通过已掌握的家系连锁分析以及全外显子组测序分析等遗传学及基因组学手段,对一个非梗阻性无精子症伴进行性肢体无力的患者大家系进行临床资料收集和分子生物学技术检测,旨在揭示其致病基因及发生机制。在前期研究的基础上,探索piRNA生成通路相关基因突变与生精障碍以及IHH之间的关系,探讨部分piRNA通路相关基因位点单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphisms,SNPs)与精子发生障碍的相关性。材料与方法:绘制系谱图,将家系中的先证者和亲缘关系较远的一名患者进行全基因组外显子测序,将测序结果进行生物信息学分析。由于该疾病的遗传模式符合X性染色隐性遗传,所以进一步做了X染色体连锁分析。筛选出候选突变基因后,对家系中的其他患者及家系成员进行Sanger测序验证。最后对先证者做了股四头肌病理活检,并通过实时定量PCR、免疫组化等生物技术学方法分析突变基因在患者股四头肌里的表达情况。在piRNA生成通路相关基因突变与生精障碍的相关性研究中,实验选取非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia,NOA)患者106例为实验组(低促性腺激素水平的无精子症47例和高促性腺激素水平无精子症59例),生精功能正常捐精者60例为对照组,构建DNA样本文库。针对piRNA生成通路相关的14个基因的全部外显子制备RNA探针,然后通过液相定点捕获及测序等相关生物技术手段,研究piRNA生成通路相关基因在各组人群中的基因突变频率情况。利用生物信息学的方法,将捕获测序结果与千人基因组计划的北京汉族(CHB)和南方汉族(CHS)人群的遗传变异结果进行比较,探讨正常人群和生精障碍患者piRNA生成通路相关基因的突变谱差异。在前面研究的基础上,收集342例特发性非梗阻性无精子症作为实验组,选择493例精液质量正常的捐精者为对照组,利用改良多重连接反应(improved multiple ligase detection reaction,iMLDR)检测技术对ASZ1,PIWIL1,TDRD1,TDRD9,MOV10L1基因的8个SNPs位点进行了基因型分型,芯片检测率>95%的位点纳入最后数据分析,利用哈迪-温伯格平衡定律、SAS9.1.3软件对数据资料进行统计学分析,P<0.05为具有统计学意义。结果:全外显子组测序,X染色体连锁分析及后续的验证结果显示基因蛋白脂蛋白2(proteolipid protein 2,PLP2)(c.265 C>T;p.L 89 F)和基因卷曲螺旋结构域22(coiled-coil domain containing,CCDC22)(c.977 C>T;p.T 326 M)同时存在纯合突变,在家系中以X染色体隐形遗传的方式存在。该位点在物种间相对保守,且部分蛋白功能预测软件预测该位点突变可能致病。PLP2和CCDC22这两个基因在男性不育及进行性肢体无力等方面的研究尚无报道。对先证者进行股四头肌病理活检发现,骨骼肌呈肌营养不良样病理改变,然而对活检组织进行了RT-PCR,发现CCDC22基因在实验组与对照组相比,表达量增加(P<0.05),而PLP2基因则相反,在实验组中的表达量明显下降(P<0.01),免疫组化分析提示,这两个因子均在骨骼肌细胞浆内表达,表达在实验组和对照者之间无明显差异。通过对14个piRNA生成通路相关候选基因进行高通量测序分析,发现MOV10L1,TDRD9,ASZ1,PIWIL3,PIWIL4,TDRD1,MAEL等基因罕见位点突变频率在实验组显著高于对照组,提示MOV10L1等基因突变可能是中国汉族人群精子发生障碍发生的重要风险因素。然而DDX4,GPAT2,HSPA2,MYBL1,PIWIL1,PIWIL2等基因突变频率在对照组明显高于实验组,提示DDX4等基因的某些突变可能对精子生成无明显影响或者有保护意义。通过SNPs位点分析,发现有7个基因10个SNP位点突变频率在实验组中与对照者相比有较大差异。提示这些基因的SNP突变可能是中国人群精子发生障碍的遗传易感因素,位点包括:ASZ1:rs1029396,PIWIL1:rs1106042和rs2242363,TDRD1:rs77559927,TDRD9:rs45550534和rs3783312,MOV10L1:rs2294396和rs760749。扩大样本对其中的8个SNP位点进行了等位基因频率分析,发现TDRD1基因的rs77559927位点T等位基因频率实验组显著高于对照组,p=0.032(<0.05),提示该位点的变异可能对精子生成有一定的影响,其余各位点最小等位基因频率未见统计学差异。然后对rs77559927位点做了显性/隐性模式分析,显性模式(TT vs TC+CC)显示TT基因型在实验组与对照组间有统计学差异(P=0.03,OR=0.73,95%CI:0.56-0.97),提示TDRD1基因rs77559927T>C可能对精子生成有保护作用。进一步对8个位点做了单体型分析,结果发现TDRD9单体型AG(rs4555053,rs378331)的比例在对照组中高于实验组(P=0.016,OR=1.598,95%CI:1.088-2.346),提示该单体型可能是精子生成的一个的保护因素,而其他单体型比例在实验组和对照组间无统计学差异。结论:首次借助全外显子组测序及X染色体连锁分析等技术在一个男性不育伴双下肢进行性无力家系中发现新的候选突变基因:PLP2(c.265 C>T;p.L89 F)和CCDC22(c.977 C>T;p.T 326 M),提示PLP2和CCDC22基因联合突变可能是此X染色体隐性遗传性男性不育伴双下肢进行性无力家系的致病原因,但这两个基因突变是否使直接导致不育的原因及其具体作用机制尚需进一步研究。MOV10L1,TDRD9,ASZ1,PIWIL3,PIWIL4,TDRD1,MAEL等基因罕见位点突变可能是精子发生障碍发生的重要风险因子。TDRD1,TDRD9基因多态性改变可能是中国汉族人群精子发生障碍的遗传易感因素。