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目的:
比较蚂蟥水提物(aqueous extract of Whitmaniapigra Whitman，AW)结肠迟释微丸(colon delayed-release pellets，CDP)与普通微丸(regular pellets，RP)的抗血栓作用，并基于核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)通路探讨AW抑制静脉血栓(venous thrombosis，VT)的作用机制。
方法:
1.CDP与RP抗血栓作用比较的研究
(1)抗凝血时效关系试验:新西兰兔按体重随机分为3组，即正常对照组、RP组(43.7mg/kg/d，相当于蚂蟥干粉38.3mg/kg/d)和CDP组(64mg/kg/d，相当于蚂蟥干粉38.3mg/kg/d)。毛细管法检测给药前、灌胃给受试物后0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8和10h新西兰兔的凝血时间。
(2)抗凝血量效关系试验:新西兰按体重随机分为16组，分别为正常对照组、RP组(10.9、21.8、32.8、43.7、65.6、87.4和131.1mg/kg/d)、CDP组(16、32、48、64、96、128和192mg/kg/d)和阿司匹林组(2.88 mg/kg/d)。RP和CDP各给药剂量相当于蚂蟥干粉9.6、19.2、28.8、38.3、57.5、76.6、114.9mg/kg/d。毛细管法检测正常对照组、RP组和阿司匹林组灌胃给药后1.5h及CDP组灌胃给药后6h新西兰兔的凝血时间。
(3)完全结扎法诱导大鼠下腔静脉血栓试验:大鼠按体重随机分为6组，分别为模型对照组、RP低、高剂量组(59.4、118.8mg/kg/d，相当于蚂蟥干粉52、104mg/kg/d)、CDP低、高剂量组(86.8、173.6mg/kg/d，相当于蚂蟥干粉52、104mg/kg/d)和阿司匹林组(7.8 mg/kg/d)。模型对照组大鼠灌胃给予蒸馏水后立即造模，RP低、高剂量组和阿司匹林对照组大鼠灌胃给药后1.5h造模，CDP低、高剂量组大鼠给药后6h后造模。各组动物造模6h后分离血栓，称量血栓湿重，计算血栓形成抑制率。
(4)大鼠动-静脉旁路血栓试验:大鼠按体重随机分为6组，分别为模型对照组、RP低、高剂量组(59.4、118.8mg/kg/d，相当于蚂蟥干粉52、104mg/kg/d)、CDP低、高剂量组(86.8、173.6mg/kg/d，相当于蚂蟥干粉52、104mg/kg/d)，阿司匹林组(7.8 mg/kg/d)。模型对照组大鼠灌胃给予蒸馏水后立即造模，RP低、高剂量组和阿司匹林对照组大鼠灌胃给药后1.5h造模，CDP低、高剂量组大鼠给药后6h后造模。各组大鼠造模15min后分离血栓，称量血栓湿重，计算血栓形成抑制率。
(5)FeCl3诱导大鼠颈动脉血栓试验:大鼠按体重随机分为7组，分别为假手术组、模型对照组、RP低、高剂量组(59.4、118.8mg/kg/d，相当于蚂蟥干粉52、104mg/kg/d)、CDP低、高剂量组(86.8、173.6mg/kg/d，相当于蚂蟥干粉52、104mg/kg/d)和氯吡格雷组(30 mg/kg/d)。假手术组、模型对照组、RP低、高剂量组大鼠灌胃给药后1.5h造模，氯吡格雷组大鼠灌胃给药后3h造模，CDP低、高剂量组大鼠灌胃给药后6h后造模。各组动物造模40min后分离血栓，进行组织病理学分析，计算血栓形成百分比及血栓形成抑制率。
2.AW抑制静脉血栓机制研究
(1)FeCl3诱导大鼠下腔静脉血栓模型建立
①FeCl3造模浓度对血栓形成的影响:大鼠按体重随机分为4组，分别为假手术组、5％、10％和20％FeCl3溶液组。各浓度FeCl3溶液外敷下腔静脉5min后抽出滤纸，再让血栓稳定形成30min后分离血栓，称量血栓湿重，进行组织病理学分析。
②清洗造模处血管对血栓形成的影响:大鼠按体重随机分为2组，10％FeCl3溶液造模清洗组和不清洗组。10％FeCl3溶液外敷下腔静脉5min后抽出滤纸，采用清洗和不清洗造模处血管后再让血栓稳定形成30min后分离血栓，称量血栓湿重。
③血栓形成时间的影响:大鼠按体重随机分为6组，造模组(20min、30min和40min)和华法林预防给药组(20min、30min和40min)。造模组大鼠灌胃给予蒸馏水，华法林预防给药组灌胃给予0.2mg/kg/d的华法林;每天灌胃一次，连续灌胃5天，于末次给药后1h进行造模，10％FeCl3溶液外敷下腔静脉5min后抽出滤纸，再让血栓稳定形成相应时间(20、30和40min)后分离血栓，称量血栓湿重。
(2)AW抑制FeCl3诱导大鼠下腔静脉血栓机制研究
大鼠按体重随机分为5组，分别为假手术组，模型对照组、AW冻干粉低、高剂量组(14.6、29.2mg/kg/d，相当于蚂蟥干粉52、104mg/kg/d)及华法林组(0.2 mg/kg/d)。每天灌胃给药一次，连续给药5天。各组动物末次给药后1h造模，造模35min后颈动脉采血，进行活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)、凝血活酶时间(prothrombin time，PT)、凝血酶时间(thrombin time，TT)、血常规和全血粘度检测;采血结束后分离血栓，称量血栓湿重;硫代巴比妥酸法检测血管组织丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量;黄嘌呤氧化酶法检测血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力;DTNB循环反应测定血清总谷胱甘肽(total glutathione，T-GSH)、氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione，GSSG)和还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量;显色法检测血清中过氧化氢酶(catalase，CAT)活力和总抗氧化能力(T-AOC);ELISA法检测血浆组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator，tPA)和纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1);荧光探针(DCFH-DA)观察血管组织内活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，免疫荧光法观察血管组织Nrf2蛋白的表达，Westernblot法检测血管组织内磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)、Akt、p-Akt、Nrf2、血红素加氧酶-1(heme oxygenase 1，HO-1)蛋白表达。
结果:
1.CDP与RP的抗凝血抗血栓作用研究
(1)抗凝血时效关系试验:与正常对照组比较，RP组和CDP组分别在给药后0.5h和4h显著延长新西兰兔的凝血时间(P≤0.05)，在给药后1.5h和6h抗凝血作用达到最强，且抗凝血作用分别维持1h和4h。
(2)抗凝血量效关系试验:与正常对照组比较，RP和CDP均能剂量依赖性地延长凝血时间，且CDP的抗凝血作用显著强于RP。
(3)完全结扎法诱导大鼠下腔静脉血栓试验:与模型对照组比较，RP和CDP均能剂量依赖性的抑制大鼠下腔静脉血栓形成，且CDP低、高剂量抗大鼠下腔静脉血栓形成作用均显著强于RP的低、高剂量组。
(4)大鼠动-静脉旁路血栓试验:与模型对照组比较，RP和CDP均能剂量依赖性地抑制大鼠动-静脉旁路血栓形成，CDP高剂量抗大鼠动-静脉旁路血栓形成作用显著强于RP高剂量组(P≤0.05)。
(5)FeCl3诱导大鼠颈动脉血栓试验:与模型对照组比较，RP和CDP均能有效抑制大鼠下腔静脉血栓形成(P≤0.01)，高剂量组CDP和RP血栓形成抑制率分别为19.2％和17.1％。
2.AW抑制静脉血栓机制研究
(1)FeCl3诱导大鼠下腔静脉血栓模型建立
①假手术组不形成血栓，5％、10％和20％FeCl3溶液组大鼠均有血栓形成(与假手术组比P≤0.05)，其中10％FeCl3溶液组大鼠血栓形成显著多于5％FeCl3溶液组(P≤0.05)。
②各造模组大鼠形成的血栓无明显差异，但10％FeCl3溶液造模不清洗组大鼠形成的血栓更均一稳定。
③各造模组大鼠形成的血栓无明显差异，其中华法林预防给药后造模30min大鼠形成的血栓明显减少(与造模30min组比P≤0.05)。
(2)AW抑制FeCl3诱导大鼠下腔静脉血栓机制研究
与假手术组相比，模型对照组大鼠形成大量血栓(P≤0.01)、全血粘度(P≤0.05)、血管组织内ROS水平和MDA含量(P≤0.01)和血浆PAI-1(P≤0.05)水平、血管组织内PI3K(P≤0.05)和p-Akt(P≤0.01)蛋白表达显著增加;而血清SOD(P≤0.05)、CAT(P≤0.01)和T-AOC(P≤0.05)活力，血清T-GSH(P≤0.01)含量和GSH/GSSG(P≤0.01)比值，血浆tPA(P≤0.01)水平，血管组织内Nrf2的荧光强度下降，Nrf2(P≤0.01)和HO-1(P≤0.01)蛋白表达显著减少。
与模型对照组相比，AW剂量依赖性地抑制静脉血栓形成，高剂量AW的血栓形成抑制率为35.0％。AW对APTT、PT、TT、血常规、全血黏度、PAI-1和tPA均无影响。与模型对照组比较，高剂量AW使血清SOD、CAT和T-AOC活力分别提高22.8％(P≤0.01)、4.6％(P≤0.01)和67.0％(P≤0.05)，T-GSH含量和GSH/GSSG比值分别增加86.0％(P≤0.05)和503.9％(P≤0.05)，血管组织内MDA和血清中TNF-α含量分别降低39.3％(P≤0.01)和21.4％(P≤0.05)，降低血管组织内ROS水平和增强Nrf2的荧光强度。与模型对照组比较，高剂量的AW使血管组织中PI3K和p-Akt蛋白表达分别下调36.6％(P≤0.05)和46.4％(P≤0.01)，Nrf2和HO-1蛋白表达分别上调106.9％(P≤0.05)和58.2％(P≤0.05)。
结论:
本实验条件下，RP和CDP均能延长凝血时间和抑制血栓形成，但CDP抗凝血抗血栓作用优于RP，且CDP对VT的抑制作用强于动脉血栓;FeCl3诱导下腔静脉血栓形成的最佳造模条件为:10％FeCl3外敷下腔静脉5min后不清洗造模处血管，再让血栓稳定形成30min;AW可通过激活Nrf2抑制氧化应激保护血管内皮而防治FeCl3诱导的下腔静脉血栓形成。
比较蚂蟥水提物(aqueous extract of Whitmaniapigra Whitman，AW)结肠迟释微丸(colon delayed-release pellets，CDP)与普通微丸(regular pellets，RP)的抗血栓作用，并基于核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)通路探讨AW抑制静脉血栓(venous thrombosis，VT)的作用机制。
方法:
1.CDP与RP抗血栓作用比较的研究
(1)抗凝血时效关系试验:新西兰兔按体重随机分为3组，即正常对照组、RP组(43.7mg/kg/d，相当于蚂蟥干粉38.3mg/kg/d)和CDP组(64mg/kg/d，相当于蚂蟥干粉38.3mg/kg/d)。毛细管法检测给药前、灌胃给受试物后0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8和10h新西兰兔的凝血时间。
(2)抗凝血量效关系试验:新西兰按体重随机分为16组，分别为正常对照组、RP组(10.9、21.8、32.8、43.7、65.6、87.4和131.1mg/kg/d)、CDP组(16、32、48、64、96、128和192mg/kg/d)和阿司匹林组(2.88 mg/kg/d)。RP和CDP各给药剂量相当于蚂蟥干粉9.6、19.2、28.8、38.3、57.5、76.6、114.9mg/kg/d。毛细管法检测正常对照组、RP组和阿司匹林组灌胃给药后1.5h及CDP组灌胃给药后6h新西兰兔的凝血时间。
(3)完全结扎法诱导大鼠下腔静脉血栓试验:大鼠按体重随机分为6组，分别为模型对照组、RP低、高剂量组(59.4、118.8mg/kg/d，相当于蚂蟥干粉52、104mg/kg/d)、CDP低、高剂量组(86.8、173.6mg/kg/d，相当于蚂蟥干粉52、104mg/kg/d)和阿司匹林组(7.8 mg/kg/d)。模型对照组大鼠灌胃给予蒸馏水后立即造模，RP低、高剂量组和阿司匹林对照组大鼠灌胃给药后1.5h造模，CDP低、高剂量组大鼠给药后6h后造模。各组动物造模6h后分离血栓，称量血栓湿重，计算血栓形成抑制率。
(4)大鼠动-静脉旁路血栓试验:大鼠按体重随机分为6组，分别为模型对照组、RP低、高剂量组(59.4、118.8mg/kg/d，相当于蚂蟥干粉52、104mg/kg/d)、CDP低、高剂量组(86.8、173.6mg/kg/d，相当于蚂蟥干粉52、104mg/kg/d)，阿司匹林组(7.8 mg/kg/d)。模型对照组大鼠灌胃给予蒸馏水后立即造模，RP低、高剂量组和阿司匹林对照组大鼠灌胃给药后1.5h造模，CDP低、高剂量组大鼠给药后6h后造模。各组大鼠造模15min后分离血栓，称量血栓湿重，计算血栓形成抑制率。
(5)FeCl3诱导大鼠颈动脉血栓试验:大鼠按体重随机分为7组，分别为假手术组、模型对照组、RP低、高剂量组(59.4、118.8mg/kg/d，相当于蚂蟥干粉52、104mg/kg/d)、CDP低、高剂量组(86.8、173.6mg/kg/d，相当于蚂蟥干粉52、104mg/kg/d)和氯吡格雷组(30 mg/kg/d)。假手术组、模型对照组、RP低、高剂量组大鼠灌胃给药后1.5h造模，氯吡格雷组大鼠灌胃给药后3h造模，CDP低、高剂量组大鼠灌胃给药后6h后造模。各组动物造模40min后分离血栓，进行组织病理学分析，计算血栓形成百分比及血栓形成抑制率。
2.AW抑制静脉血栓机制研究
(1)FeCl3诱导大鼠下腔静脉血栓模型建立
①FeCl3造模浓度对血栓形成的影响:大鼠按体重随机分为4组，分别为假手术组、5％、10％和20％FeCl3溶液组。各浓度FeCl3溶液外敷下腔静脉5min后抽出滤纸，再让血栓稳定形成30min后分离血栓，称量血栓湿重，进行组织病理学分析。
②清洗造模处血管对血栓形成的影响:大鼠按体重随机分为2组，10％FeCl3溶液造模清洗组和不清洗组。10％FeCl3溶液外敷下腔静脉5min后抽出滤纸，采用清洗和不清洗造模处血管后再让血栓稳定形成30min后分离血栓，称量血栓湿重。
③血栓形成时间的影响:大鼠按体重随机分为6组，造模组(20min、30min和40min)和华法林预防给药组(20min、30min和40min)。造模组大鼠灌胃给予蒸馏水，华法林预防给药组灌胃给予0.2mg/kg/d的华法林;每天灌胃一次，连续灌胃5天，于末次给药后1h进行造模，10％FeCl3溶液外敷下腔静脉5min后抽出滤纸，再让血栓稳定形成相应时间(20、30和40min)后分离血栓，称量血栓湿重。
(2)AW抑制FeCl3诱导大鼠下腔静脉血栓机制研究
大鼠按体重随机分为5组，分别为假手术组，模型对照组、AW冻干粉低、高剂量组(14.6、29.2mg/kg/d，相当于蚂蟥干粉52、104mg/kg/d)及华法林组(0.2 mg/kg/d)。每天灌胃给药一次，连续给药5天。各组动物末次给药后1h造模，造模35min后颈动脉采血，进行活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)、凝血活酶时间(prothrombin time，PT)、凝血酶时间(thrombin time，TT)、血常规和全血粘度检测;采血结束后分离血栓，称量血栓湿重;硫代巴比妥酸法检测血管组织丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量;黄嘌呤氧化酶法检测血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力;DTNB循环反应测定血清总谷胱甘肽(total glutathione，T-GSH)、氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione，GSSG)和还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量;显色法检测血清中过氧化氢酶(catalase，CAT)活力和总抗氧化能力(T-AOC);ELISA法检测血浆组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator，tPA)和纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1);荧光探针(DCFH-DA)观察血管组织内活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，免疫荧光法观察血管组织Nrf2蛋白的表达，Westernblot法检测血管组织内磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)、Akt、p-Akt、Nrf2、血红素加氧酶-1(heme oxygenase 1，HO-1)蛋白表达。
结果:
1.CDP与RP的抗凝血抗血栓作用研究
(1)抗凝血时效关系试验:与正常对照组比较，RP组和CDP组分别在给药后0.5h和4h显著延长新西兰兔的凝血时间(P≤0.05)，在给药后1.5h和6h抗凝血作用达到最强，且抗凝血作用分别维持1h和4h。
(2)抗凝血量效关系试验:与正常对照组比较，RP和CDP均能剂量依赖性地延长凝血时间，且CDP的抗凝血作用显著强于RP。
(3)完全结扎法诱导大鼠下腔静脉血栓试验:与模型对照组比较，RP和CDP均能剂量依赖性的抑制大鼠下腔静脉血栓形成，且CDP低、高剂量抗大鼠下腔静脉血栓形成作用均显著强于RP的低、高剂量组。
(4)大鼠动-静脉旁路血栓试验:与模型对照组比较，RP和CDP均能剂量依赖性地抑制大鼠动-静脉旁路血栓形成，CDP高剂量抗大鼠动-静脉旁路血栓形成作用显著强于RP高剂量组(P≤0.05)。
(5)FeCl3诱导大鼠颈动脉血栓试验:与模型对照组比较，RP和CDP均能有效抑制大鼠下腔静脉血栓形成(P≤0.01)，高剂量组CDP和RP血栓形成抑制率分别为19.2％和17.1％。
2.AW抑制静脉血栓机制研究
(1)FeCl3诱导大鼠下腔静脉血栓模型建立
①假手术组不形成血栓，5％、10％和20％FeCl3溶液组大鼠均有血栓形成(与假手术组比P≤0.05)，其中10％FeCl3溶液组大鼠血栓形成显著多于5％FeCl3溶液组(P≤0.05)。
②各造模组大鼠形成的血栓无明显差异，但10％FeCl3溶液造模不清洗组大鼠形成的血栓更均一稳定。
③各造模组大鼠形成的血栓无明显差异，其中华法林预防给药后造模30min大鼠形成的血栓明显减少(与造模30min组比P≤0.05)。
(2)AW抑制FeCl3诱导大鼠下腔静脉血栓机制研究
与假手术组相比，模型对照组大鼠形成大量血栓(P≤0.01)、全血粘度(P≤0.05)、血管组织内ROS水平和MDA含量(P≤0.01)和血浆PAI-1(P≤0.05)水平、血管组织内PI3K(P≤0.05)和p-Akt(P≤0.01)蛋白表达显著增加;而血清SOD(P≤0.05)、CAT(P≤0.01)和T-AOC(P≤0.05)活力，血清T-GSH(P≤0.01)含量和GSH/GSSG(P≤0.01)比值，血浆tPA(P≤0.01)水平，血管组织内Nrf2的荧光强度下降，Nrf2(P≤0.01)和HO-1(P≤0.01)蛋白表达显著减少。
与模型对照组相比，AW剂量依赖性地抑制静脉血栓形成，高剂量AW的血栓形成抑制率为35.0％。AW对APTT、PT、TT、血常规、全血黏度、PAI-1和tPA均无影响。与模型对照组比较，高剂量AW使血清SOD、CAT和T-AOC活力分别提高22.8％(P≤0.01)、4.6％(P≤0.01)和67.0％(P≤0.05)，T-GSH含量和GSH/GSSG比值分别增加86.0％(P≤0.05)和503.9％(P≤0.05)，血管组织内MDA和血清中TNF-α含量分别降低39.3％(P≤0.01)和21.4％(P≤0.05)，降低血管组织内ROS水平和增强Nrf2的荧光强度。与模型对照组比较，高剂量的AW使血管组织中PI3K和p-Akt蛋白表达分别下调36.6％(P≤0.05)和46.4％(P≤0.01)，Nrf2和HO-1蛋白表达分别上调106.9％(P≤0.05)和58.2％(P≤0.05)。
结论:
本实验条件下，RP和CDP均能延长凝血时间和抑制血栓形成，但CDP抗凝血抗血栓作用优于RP，且CDP对VT的抑制作用强于动脉血栓;FeCl3诱导下腔静脉血栓形成的最佳造模条件为:10％FeCl3外敷下腔静脉5min后不清洗造模处血管，再让血栓稳定形成30min;AW可通过激活Nrf2抑制氧化应激保护血管内皮而防治FeCl3诱导的下腔静脉血栓形成。