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木质纤维素是世界上来源最广泛的,可用于生产生物燃料和大宗化学品的可再生生物质资源。可经酸或酶水解成戊糖(木糖和阿拉伯糖)和己糖(葡萄糖、半乳糖和甘露糖)。利用木质纤维降解液发酵生产生物能源和生物大宗化学品,能有效地降低生产成本和减少从石油中提取获得化学品带来的环境污染问题。因而,利用微生物发酵转化葡萄糖和木糖是纤维素产业发展的关键。当前葡萄糖的利用已经很大改善,但是木糖的利用仍旧存在诸多难题。因此本论文通过木糖代谢途径和木糖转运途径对木糖的利用机制进行了探索。第一部分木糖代谢通路改造。目的：构建RBS文库的方法调控了木糖代谢基因xylA和xylB的表达；构建glk基因RBS文库,分析glk对木糖代谢的影响；进行木糖代谢基因xylA, xylB, tktA, talB酶活的测定。方法：RBS文库的构建利用两步法同源重组；酶活测定利用粗酶液通过酶偶联机制进行酶活的测定。结果：构建了xylA和xylB文库,并证实了这两个基因在木糖代谢中不是限速步骤。通过glk基因RBS文库的发酵和酶活测定,证明葡萄糖代谢基因同样能够对木糖的利用有作用,同时g,lk的酶活越低越有利于木糖的代谢和在大肠杆菌中存在葡萄糖激酶同工酶。通过对SL002进行代谢进化,生长速率提高了77%,木糖消耗速率提高了77%。第二部分通过定向进化和定点突变分析了XylE蛋白木糖转运能力。目的：构建xylE突变库；对XylE蛋白的171,175,383,388位氨基酸进行定点突变；敲除四个潜在木糖转运蛋白GatC, araE, araG, man PTS,分析四个蛋白的木糖转运能力。方法：利用CPEC的方法在pSC102质粒上构建xylE突变库；利用环状定点PCR进行定点突变；利用两步法同源重组敲除了四个木糖转运基因。结果：构建了pSC102-xylE突变库,并通过优化Mn2+浓度发现在0mM时利用Transfast taq酶进行突变库的突变率为最佳突变率0.3%；对xylE的171,175,383,388氨基酸进行定点突变为丙氨酸后分析了突变对葡萄糖和木糖转运的影响,发现这些能够同葡萄糖结合的氨基酸既不能解除葡萄糖对木糖转运的抑制,也不能影响木糖的转运,证明这些氨基酸不会影响XylE的空间结构；敲除了GatC, araE, araG, man PTS基因后不会对木糖的转运造成影响,表明四个基因转运木糖能力有限。