由细菌、病毒、寄生虫等病原微生物引起的感染性疾病严重威胁人类的生命健康。其中,以细菌性感染最为常见。虽然现有抗生素可有效控制与治疗细菌的感染,但由于不合理使用,甚至滥用,导致细菌对抗生素产生耐药性。尤其是多重耐药菌的出现,使得细菌耐药性问题日益严峻。近年来,抗菌肽(Antimicrobial Peptides,AMPs)因其广谱抗菌活性、快速杀菌效应及特有的抗菌机制引起国内外研究者们的广泛关注。与传统抗生素不同,抗菌肽的抗菌活性主要依赖于与细菌细胞膜的相互作用,这一特有的抗菌机制使其具有不易产生耐药性等诸多优势。研究表明,抗菌肽既可单独作为抗菌药物,也可与常规抗生素联合使用发挥协同效应。虽然抗菌肽具有替代传统抗生素的潜力,但代谢稳定性差及体内潜在的毒性阻碍了其进一步的研究与开发。因此,设计新型抗菌肽及其类似物以克服现有抗菌肽所存在的缺陷与不足具有重要的现实意义。围绕着如何设计具有全新结构的抗菌肽及其类似物,本论文开展了如下研究工作:1.基于活性苷元与多聚精氨酸缀合的新型抗菌肽类似物的设计研究表明,抗菌肽的阳离子性与两亲性结构特性是其发挥抗菌活性的关键因素。其中,阳离子性促使抗菌肽通过静电作用识别并附着于细菌细胞;两亲性结构则能使得抗菌肽自聚形成构象簇后与细菌细胞膜作用,通过破坏细菌细胞膜的完整性,导致细菌死亡。五环三萜类化合物是在自然界中广泛存在的天然次级代谢产物,具有抗菌、抗病毒、抗炎等多种药理作用及生物学活性。然而,由于其刚性骨架与疏水性结构引起的生物利用度低等缺陷导致五环三萜类化合物在临床应用方面受到严重制约。多聚精氨酸(Rn, n为精氨酸个数)是一类亲水性阳离子短肽,被证实与细菌细胞膜具有高亲和力,同时体现了一定的体外抗菌活性。在本研究中,我们将疏水性五环三萜活性苷元与亲水性阳离子多聚精氨酸共价缀合,使其具有抗菌肽发挥活性所需的阳离子性与两亲性结构特性,同时通过二者的缀合释放出各自潜在的抗菌活性。体外抗菌活性结果表明,当把五环三萜苷元与多聚精氨酸缀合后,其抗革兰氏阳性菌活性较单独苷元或多聚精氨酸有了显著的提高,说明五环三萜苷元与多聚精氨酸之间产生了明显的协同作用。此外,除了苷元与精氨酸的缀合物之外,其余缀合物对于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, aureus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,B.subtilis)两种革兰氏阳性菌均体现了良好的抗菌活性,其MIC值均低于10μM(1.8-8.6μM),与阳性对照培西加南相当。其中,桦木酸(betulinic acid, BA)与R3的缀合物(BAc-R3)具有低溶血性(HC50=215 μM)与高治疗指数(TI=125),且血浆稳定性明显优于培西加南。作用机制研究结果表明,BAc-R3通过破坏细菌细胞膜完整性发挥抗菌效应。2.基于多肽装订策略的新型抗菌肽的设计CATH-2是来源于鸡骨髓细胞的新型内源性抗菌肽,具有抗多种病原菌活性及免疫调节功能。研究显示,CATH-2是由一个含有脯氨酸的铰链区相连的两个α-螺旋构成。其中,包含N端两亲性α-螺旋与铰链区域的前15个氨基酸序列(C1-15)为活性必需片段。随后,E. M. Molhoek等将C1-15的2、5、12位氨基酸残基替换为疏水性色氨酸,得到抗菌活性与脂多糖中和活性均显著提高的衍生物F2,5,12W。虽然F2,5,12W较C1-15具有一定的优势,但仍存在易被酶降解、生物利用度低等问题。多肽装订策略是近年来研究者们常采取的多肽修饰策略之一,主要指通过共价键将柔性的多肽分子固定为稳定的α-螺旋结构以模拟其在天然蛋白—蛋白作用下的状态的方法。一方面,通过装订策略可以稳定多肽高级结构,增加多肽与特异性靶标的选择性,进而提高多肽生物活性;另一方面,利用装订策略对多肽进行构象限制,可以减少蛋白酶对多肽酶切位点的识别,从而改善多肽代谢性质。本研究中,我们以文献报道的F2,5,12W为先导化合物,针对其易被酶降解的问题,利用多肽装订策略,稳定F2,5,12W两亲性α-螺旋构象,使其保持高抗菌活性的同时改善酶解稳定性。同时探讨不同装订方法、不同修饰位点对于F2,5,12W抗菌活性、溶血性与血浆稳定性的影响。我们选用S-烷基化装订、烯烃装订与三氮唑装订等三种装订方法合成得到了一系列以F2,5,12W为先导肽的装订肽。体外抗菌活性评价结果显示,采用烯烃装订与以间二溴苄为交联剂的S-烷基化装订的装订肽均保持了与先导肽相当的抗菌活性(MIC=0.9-7.1μM)。其中,F2,5,12W-2,6A*-st较先导肽显著改善了血浆稳定性,同时其抗菌活性较先导肽提高了两倍(MIC=0.9-3.6μM)。综上所述,本论文共设计、合成了 30个具有阳离子性、两亲性结构特性的苷元—多聚精氨酸缀合物以及16个以F2,5,12W为先导肽的装订肽,并对其抗菌活性、溶血性、血浆稳定性进行了评价,同时探讨了初步的作用机制。本论文的创新性主要体现在以下两个方面:(1)疏水性五环三萜苷元与阳离子多聚精氨酸的共价缀合,可形成具有抗菌肽发挥活性所需的阳离子性、两亲性结构。同时,二者的结合可释放出各自潜在的抗菌活性。这种苷元-阳离子多聚精氨酸缀合物的设计为新型抗菌先导物的发现与研究提供了一种全新的结构模式。(2)通过多肽装订策略对先导抗菌肽进行构象限制的方法,筛选得到抗菌活性保持、血浆稳定性显著提高的具有装订结构的新型抗菌肽。