【摘 要】
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研究目的溶瘤腺病毒疗法被认为是一种有效的肿瘤治疗策略。溶瘤腺病毒具有肿瘤细胞特异性复制能力,在溶解肿瘤细胞同时还能高效表达所携带的目的基因共同发挥抗肿瘤作用,近年来已被用于临床肿瘤治疗。静脉给药对转移瘤的治疗有重要作用。然而,因溶瘤腺病毒在全身给药时存在肝内非特异性聚集以及宿主免疫反应作用,目前溶瘤腺病毒仅局限于局部给药,极大地限制了其临床应用。本课题拟构建一个安全有效的溶瘤腺病毒静脉递送系统,即
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.81472841,No.81572999,No.81502692）； 上海市科学技术委员会基金（No.14JC1492500）；
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研究目的溶瘤腺病毒疗法被认为是一种有效的肿瘤治疗策略。溶瘤腺病毒具有肿瘤细胞特异性复制能力,在溶解肿瘤细胞同时还能高效表达所携带的目的基因共同发挥抗肿瘤作用,近年来已被用于临床肿瘤治疗。静脉给药对转移瘤的治疗有重要作用。然而,因溶瘤腺病毒在全身给药时存在肝内非特异性聚集以及宿主免疫反应作用,目前溶瘤腺病毒仅局限于局部给药,极大地限制了其临床应用。本课题拟构建一个安全有效的溶瘤腺病毒静脉递送系统,即钙磷复合磷脂载“武装”治疗基因的溶瘤腺病毒递送系统。以Huh-7肝癌细胞构建肿瘤动物模型,静脉递送钙磷复合磷脂载IL-24基因武装化的溶瘤腺病毒（ZD55-IL-24）,评估其体内抗肿瘤效果。方案设计溶瘤腺病毒静脉递送系统的设计:通过磷酸钙沉淀溶瘤腺病毒,以能和阳离子发生相互作用的磷脂1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸单钠盐（DOPA）形成脂质双分子层包覆稳定磷酸钙/溶瘤腺病毒沉淀,最外层予以聚乙二醇2000覆盖形成亲水性保护层以延长血液循环时间有助于静脉递送。递送系统性能评估、抗肿瘤疗效验证:首先对构建的静脉递送系统进行表征、优化,并对该系统进行功能评价（稳定性、长循环能力、肝毒性及免疫逃逸能力）,最后检测其体内分布、评估瘤内靶向效率,考察体内抗肿瘤效率。研究内容与结果本课题构建了钙磷复合磷脂载溶瘤腺病毒纳米递送系统,平均粒径为121 nm,电荷为-10.1 m V,分散性良好。性能评价结果显示,PLC-ZD55-IL-24在4℃储存条件下,纳米粒可稳定10 d;血清稳定性检测表明其可以抵抗血清诱导的凝集,延长体内循环时间;静脉递送PLC-ZD55-IL-24后,BALB/c小鼠体内血清白介素-6（IL-6）水平、血清丙氨酸转氨酶（ALT）,天冬氨酸转氨酶（AST）水平无显著增高,病理分析显示小鼠肝组织无明显肝细胞破坏,且可抵抗小鼠体内预存中和抗体中和作用,在预免疫的荷Hepa1-6细胞移植瘤小鼠体内实现瘤内靶向。细胞水平实验显示,PLC-ZD55-IL-24通过抑制Huh-7肿瘤细胞增殖、诱导凋亡发挥抗肿瘤作用。在Huh-7肝癌移植瘤裸鼠体内静脉注射PLC-ZD55-IL-24后,通过实时荧光定量q PCR方法检测病毒基因拷贝数显示PLC-ZD55-IL-24注射组显著减少了肝、脾等单核吞噬系统内的病毒基因拷贝数,延长了病毒血液循环时间、实现了有效的瘤内靶向。离体组织荧光成像分析进一步验证了该递送系统的靶向效率。此外,增加给药剂量可增加瘤内靶向效率而对瘤/肝比无显著影响。Huh-7肝癌移植瘤裸鼠经PLC-ZD55-IL-24治疗后,瘤内目的基因IL-24的m RNA及蛋白表达水平明显高于ZD55-IL-24治疗组,高、低剂量治疗组抑瘤率分别为54.62%、37.40%,提示增加PLC-ZD55-IL-24治疗剂量可显著增加其抗肿瘤疗效。治疗终点血清生化检测及重要脏器切片HE染色结果未见明显脏器功能损害。结论本课题成功构建了钙磷复合磷脂载溶瘤腺病毒静脉递送系统（PLC-ZD55-IL-24）。钙磷复合磷脂覆盖在溶瘤腺病毒表面可减少病毒的肝内聚集、延长病毒的血液循环时间、保护病毒免于中和抗体中和作用。静脉注射PLC-ZD55-IL-24未显示明显肝毒性,未显著诱导内在免疫反应发生,同时可实现有效瘤内靶向,在Huh-7肝癌移植瘤模型中发挥显著抗肿瘤效应。此外,增加PLC-ZD55-IL-24静脉注射剂量可提高抗肿瘤疗效、改善预后,且未引起严重不良反应。因此,我们构建的钙磷复合磷脂载溶瘤腺病毒系统有可能为改善溶瘤腺病毒静脉递送提供了一种安全有效的递送策略。
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