【摘 要】
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目的:急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia,ALL）是儿童最常见的恶性肿瘤。儿童ALL的无事件生存率（event free survival,EFS）达到81%,但仍有15%-20%的复发率,且一旦复发,治愈率不足40%。糖皮质激素（Glucocorticoids,GCs）耐药是ALL复发的主要原因之一。Micro RNAs（MiRNA）是约22个核苷酸的小
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目的:急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia,ALL）是儿童最常见的恶性肿瘤。儿童ALL的无事件生存率（event free survival,EFS）达到81%,但仍有15%-20%的复发率,且一旦复发,治愈率不足40%。糖皮质激素（Glucocorticoids,GCs）耐药是ALL复发的主要原因之一。Micro RNAs（MiRNA）是约22个核苷酸的小非编码单链RNA,可以通过多种机制参与GCs敏感性的调控,与ALL细胞对GCs耐药密切相关。本研究首先通过数据库分析miR-145在ALL患儿中的表达情况及其对ALL预后的影响,进而探讨miR-145对人T-ALL细胞系CEM-C7和CEM-C1细胞增殖、凋亡和自噬的影响,及其是否可以逆转GCs耐药CEM-C1细胞对地塞米松（Dexamethasone,DEX）的耐药性,为探索儿童ALL耐药性的靶点提供新的思路。方法:1.生物信息学:应用GEO数据库数据集分析miR-145在ALL儿童中的表达水平,通过TARGET数据库数据揭示miR-145和儿童ALL预后之间的联系。2.细胞培养:运用体外细胞培养技术孵育对DEX具有耐药性的人AL L细胞株CEM-C1细胞株及亲本细胞株CEM-C7。3.脂质体转染:在CEM-C1细胞中应用lipo-2000介导脂质体转染技术转入miR-145模拟物mimic及其NC阴性对照,miR-145抑制剂inhibito r及其NC阴性对照,调控miR-145在细胞中表达,并分别将其分为MM、MMN、MI、MIN四个组。4.细胞增殖抑制实验:采用CCK-8试剂盒检测检测不同浓度DEX（20、40、80、160和320 mg/ml）对四组细胞增殖的抑制情况,从而揭示miR-145在CEM-C1对GCs反应性中发挥的作用。5.吖啶橙染色:探索miR-145对CEM-C1细胞凋亡的影响。6.流式细胞术:分析miR-145对CEM-C1细胞凋亡的影响。7.实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）:检测miR-145在CEM-C1细胞和CEM-C7细胞中的表达,以及miR-145、促凋亡基因Bax和抗凋亡基因Bcl-2、自噬相关基因LC3及Beclin-1、多药耐药基因MDR1在四组细胞中的表达情况。8.细胞免疫印迹实验（Western Blot,WB）:检测MDR1蛋白在CE M-C1细胞和CEM-C7细胞中的表达,以及转染后四组细胞中miR-145、凋亡基因Bax和抵抗凋亡基因Bcl-2、自噬相关蛋白LC3及Beclin-1、多药耐药蛋白MDR1的表达情况。9.3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）干预对照MMN组和miR-145高表达的MM组细胞,将其分为MMN、MMN+3-MA、MM、MM+3-MA四组细胞,作用24h后检测自噬相关蛋白LC3及Beclin-1、耐药蛋白MDR1的表达,进一步研究自噬与ALL细胞GCs抗性的关系。结果:1.数据库结果显示miR-145在ALL患儿中的表达水平显著降低（P<0.001）。2.miR-145高表达组ALL儿童的生存时间高于低表达组（P<0.001）。3.耐药蛋白MDR1在CEM-C1细胞中的表达水平显著高于CEM-C7细胞。4.miR-145在CEM-C1细胞中的表达显著低于CEM-C7细胞。5.miR-145高表达后增加了GCs对CEM-C1细胞的增殖抑制作用。6.促凋亡基因/蛋白Bax的表达在miR-145高表达组中增加,而抗凋亡基因/蛋白Bcl-2及耐药基因/蛋白MDR1则表达减少。7.同时,miR-145增加自噬基因/蛋白Beclin 1和LC3-Ⅱ的表达诱导自噬,从而降低耐药基因/蛋白MDR1的表达。8.3-甲基腺嘌呤（3-MA）干预后,MIN+3-MA组,耐药蛋白MDR1的表达增加,且MM+3-MA组,Beclin l的表达较MIN+3-MA增加,而MDR1的表达降低。结论:1.miR-145在ALL儿童中低表达,提示患儿预后不良;2.miR-145可以通过诱导CEM-C1细胞的凋亡和自噬来逆转糖皮质激素的耐药性。
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