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主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex, MHC）k又称主要组织相容性复合基因,由一群紧密连锁的基因群构成,并且定位于动物或人的某对染色体的特定区域,呈高度多态性,其编码的分子可参与抗原递呈,制约着细胞之间的相互识别及诱导免疫应答。MHC分子分为三类,包括MHC Ⅰ、MHC Ⅱ和MHC Ⅲ,其中MHC Ⅱ位于如巨噬细胞一类的抗原提呈细胞上,可呈递外源性抗原,当细菌侵入组织中,巨噬细胞首先会识别并进行吞噬,再利用MHC分子将细菌的碎片提呈至CD4+T淋巴细胞,诱导产生辅助性T细胞免疫。作为MHC Ⅱ类分子的主要结构组成部分,γ链与α、β链在细胞内质网中聚合形成一种九聚体（αβY）3,不同于多态性的α、β链,γ链呈非多态性,因而又被命名为恒定链（Invariant chain, Ii）。Ii具有增强免疫、定向运输抗原肽等作用,临床上还用于肿瘤的治疗。抗原表位也称为抗原决定簇,是指能够被抗体或T淋巴细胞受体识别的抗原某些特定存在的区域。能被抗体识别的表位为B淋巴细胞抗原表位,能被TCR/MHC复合体识别的为T淋巴细胞抗原表位。表位疫苗的优势在于既无需分离传染性病原体,又能够减少不同优势抗原表位之间的相互干扰。为了探究Ii功能片段在不同源病毒表位串联嵌合体的增强免疫作用,以及改变不同源病毒表位的排列顺序对其免疫原性的影响,本实验根据NDV HN蛋白与BDV VP2蛋白的抗原特性及抗原表位的预测分析,以Ii功能片段作为免疫载体,选取NDV-HN （172-201AA）与BDV-VP2 （197-209AA）作为目的片段,并进行串联,同时以Ii的Cyt/TM功能片段为载体,以探究多抗原表位串联在Ii功能片段增强免疫作用中的特点。首先,通过登录GenBank数据库分别获得小鼠Ii（No.NM001042605）, BDV-VP2 （No.AY444873）以及NDV-HN （No.AY510092）序列号,利用PrimerPremier 5.0软件设计实验所需引物,以实验室保存质粒为模板,使用重叠延伸PCR法克隆目的片段NDV-HN （90bp）、Cyt/TM/HN （339bp）、HN/VP2 （141bp）. Cyt/TM/HN/VP2 （390bp）、BDV-VP2 （39bp）、Cyt/TM/VP2 （288bp）及Cyt/TM/VP2/HN （390bp）,将上述基因片段分别定向插入原核表达载体pET-32a,其中NDV-HN（90bp）与HN/VP2（141bp）还需定向插入原核表达载体pGEX-4T-1用于表达ELISA实验中的包被抗原蛋白。经测序结果鉴定各重组质粒已经功构建。其次,分别诱导表达各融合蛋白。诱导表达条件经优化后可大量表达。将大量表达的菌体反复冻融并通过超声裂解处理,提取融合蛋白后使用改良的KC1染色切胶法纯化所需目的蛋白。再经SDS-PAGE凝胶电泳检测,结果表明各个重组质粒pET-32a-Cyt/TM/VP2、pET-32a-Cyt/TM/HN、pET-32a-Cyt/TM/HN/VP2、 pET-32a-Cyt/TM/VP2/HN、pET-32a-VP2、pET-32a-HN、pET-32a-HN/VP2、 pGEX-4T-1-VP2及pGEX-4T-1-HN均正确表达,分子量分别为30.6 kDa、32.4kDa、34.6 KDa、34.6 kDa、21.4 kDa、23.3 kDa、25.2 kDa、27.4 kDa 及 29.3 kDa,与期待结果一致。最后,将上述获得的融合蛋白经Western Blot法成功鉴定免疫原性,并使用上述得到的His标签纯化融合蛋白分别免疫6-8周龄昆明系SPF级雌性小鼠,设7组实验组与一组对照组,每组4只。经三次免疫后眼球采血,分离血清并检测抗体。采用间接ELISA法检测各组血清效价。将获得的数据经统计学分析,所有免疫组小鼠都产生相应抗体,并且其效价高于0.8-1.0*104；而所有用Ii功能片段Cyt/TM作为载体的融合蛋白免疫组小鼠产生的抗体效价,均高于用单一抗原肽免疫的小鼠的约3.1至3.5倍,差异极显著（p<0.01）。进一步分析发现,两种不同抗原肽在连接Ii载体时,其排列顺序尽管不同,免疫小鼠产生的特异性的效价几乎没有差异（p>0.05）。说明在不同抗原表位串联嵌合体中单独的抗原表位顺序对其免疫原性没有影响。综上所述,本实验成功克隆7个基因片段并分别成功插入原核载体pET-32a与pGEX-4T-1,构建所需的9个重组质粒,经大量表达与纯化后获得目的蛋白,鉴定其具有免疫原性后免疫小鼠,分析各组血清效价数值得出结论：1,Ii功能片段Cyt/TM既可以增强单一表位抗原肽免疫原性,也可增强不同源病毒表位串联抗原肽忙免疫原性；2,不同源病毒表位串联抗原肽针对各病毒抗原表位可产生相应抗体且效价不低于单一表位抗原肽；3,不同抗原表位串联嵌合体中单独的多抗原表位顺序对其免疫原性没有影响。