基于吡咯并吡咯二酮的纳米荧光探针用于检测不同浓度范围的谷胱甘肽

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细胞内的硫醇化合物,例如半胱氨酸(Cys),同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)在重要细胞调节中发挥至关重要的作用。而GSH是动物体内含量最为丰富的一类生物硫醇,GSH不同的含量水平直接联系人们的病理特征,包括肝损伤,癌症,艾滋病和心血管疾病。在肿瘤细胞中GSH含量会升高,因此根据GSH的含量变化可以了解细胞是否发生病变,需要检测不同浓度范围的GSH从而判断细胞是否发生病变。人体内半胱氨酸(Cys),同型半胱氨酸(Hcy),谷胱甘肽(GSH)这三种氨基酸的结构非常相似,都含有胺基和巯基,而现如今的很多氨基酸类荧光探针都是与氨基酸中的胺基或者巯基进行反应,这三种氨基酸的检测常常受到干扰,因此设计合成能从这三种氨基酸中单独检测出某种氨基酸的荧光探针具有重要的意义。而GSH由于其分子较大,反应位阻很大,在这三种氨基酸中最难选择性检测GSH,并且需要检测出不同浓度的GSH更增大了检测的难度,现如今的荧光探针用来检测不同浓度范围的GSH都需要两个反应位点并且需要经历复杂的合成,而用一个反应位点检验不同浓度的GSH的荧光探针还没被报道,因此,设计合成只具有一个反应基团的席夫碱结构的荧光探针TPE-DPP,TPE-DPP是由DPP-CHO与TPE-NH2反应生成的席夫碱结构,可以实现对不同浓度范围GSH的比率型荧光检测。探针TPE-DPP在(THF:H2O=4:6,v/v)溶液中能够形成稳定的纳米粒子,由于纳米粒子粒径的关系,从而能与三种氨基酸发生不同的反应,且能够从三种氨基酸中单独检测出GSH。由于GSH含有多个羧基,当为低浓度的GSH时,GSH中的羧基容易电离形成GSH-,从而使TPE-DPP的C=N双键发生水解,生成DPP-CHO与TPE-NH2,DPP-CHO在溶液态时,发出很强的橙色荧光。当为高浓度的GSH时,GSH与TPE-DPP的C=N双键发生亲核加成,由于TPE-NH2的荧光发射谱图与DPP-CHO的紫外吸收谱图有一定的重叠,当发生亲核加成反应时,给电子基TPE到吸电子基DPP的FRET效应可以发生,从而使得荧光增强,从而实现对GSH不同浓度范围的检测。不仅如此,探针TPE-DPP的选择性也很高,探针TPE-DPP的荧光发射峰在578 nm处,半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)的加入发射峰强度并未出现明显的变化,而当低浓度(0-0.1 mM)的谷胱甘肽GSH加入进去时,578 nm的荧光发射峰逐渐增强,且411 nm出现新的荧光发射峰,随着GSH浓度的增加,这两个荧光发射峰的荧光强度都逐渐增强。在高浓度(0.1-1.0 mM)GSH存在的情况下,578 nm处的发射峰荧光强度继续增加,而411 nm处的荧光强度则逐渐减弱。我们还用了另外15种氨基酸验证探针TPE-DPP对GSH检测的良好的选择性,不会受其它氨基酸的影响和干扰。同时探针TPE-DPP对GSH的检测灵敏度也很高,对GSH的检出限能达到0.05μM。另外,实验表明TPE-DPP可用于对细胞内GSH的检测及荧光成像。由于TPE-DPP纳米粒子具有良好的选择性,并且有很好的灵敏性,将其做了细胞实验,由于大多数有机溶剂对细胞都有一定的损害。因此,做成水溶性荧光探针在使用过程中能够更好的减少对细胞的损害,能很好的适应细胞环境,在细胞荧光成像过程中对细胞的损害最小。因此,通过两亲聚合物F127将TPE-DPP进行包裹,制备成水溶性TPE-DPP-F127纳米粒子,进行细胞成像,用了GSH的抑制剂做对照实验证明了TPE-DPP能够在细胞中选择性检测GSH,并取得了很好的成像效果。
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