研究背景研究表明,滋养血管(vasa vasorum, V V)增生与动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)斑块的形成、进展及易损性密切相关,而VV增生的程度和分布范围受到促血管生长因子与抑血管生长因子间相互作用的调节。其中,血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)家族及血管生成素(angiopoietin, ANGPT)家族起着重要的作用。研究表明,VEGF家族重要成员VEGF-A能够通过促进单核细胞活化、粘附、迁移及增加内皮细胞的通透性而促进内膜增生、加重AS。人冠状动脉斑块免疫组织化学染色显示,VEGF-A在各个时期的斑块均有阳性染色,并且其阳性染色率在动脉粥样化的病变处比弥散性内膜增厚病变处明显增加。人颈动脉斑块免疫组化染色显示,不稳定斑块中血管生成素家族成员ANGPT-1的表达下降而ANGPT-2的表达升高. ANGPT-1与ANGPT-2的比值在出血的斑块中减小,并且ANGPT-1/ANGPT-2与斑块新生血管密度呈负相关。血管新生因子的表达受到缺氧诱导因子la (hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α), E26转化特异序列1(E26 transformation specific sequence 1, Ets-1)等多种转录因子的调控。HIF-1α的蛋白稳定性及其转录活性受到缺氧依赖性和非缺氧依赖性两种信号通路的调控。AS斑块内膜增厚超过氧气的弥散距离以及斑块内活跃的炎症反应状态等因素均可引起HIF-1α的表达增加。多种炎症因子和生长因子可通过激活PI3K/Akt/HIF-1α通路增加促血管生成因子VEGF-A. ANGPT-2.ANGPT-4等的表达。而Ets转录因子家族成员Ets-1可通过与ANGPT-2基因上的Ets结合位点结合而激活ANGPT-2的启动子活性,增加ANGPT-2的表达。复方中药通心络(Tongxinluo,TXL)于1996年被我国食品与药品监督管理局批准用于冠心病心绞痛和缺血性脑卒中的治疗。本实验室前期的研究发现,在小鼠心肌梗死和心力衰竭模型中,TXL干预能够显著增加小鼠缺血心肌区内的新生血管密度、减轻心室重构、改善心功能。那么斑块VV增生对于早期斑块的形成有无影响?斑块VV增生促进早期斑块形成的机制是什么?TXL在抗心肌缺血的同时是否会对斑块的血管新生产生相同的促进作用进而对斑块的发生及稳定性产生影响?基于以上分析,本研究拟采用高脂喂养载脂蛋白E敲基因(apolipoprotein E deficient,apoE-/-)小鼠建立早期AS斑块模型,观察斑块VV增生对于早期斑块形成的影响,并进一步探究TXL干预对AS斑块血管新生以及早期斑块形成的影响及可能的作用机制,也为该药在临床上的应用提供更多实验依据。研究目的1.观察TXL干预对apoE-/-小鼠斑块W增生及早期斑块形成的影响；2.探讨TXL干预影响血管新生的可能机制。研究方法1.TXL超微粉及其溶液的制备TXL复方中药组分制备成直径<10μm的超微粉,体内实验部分,用生理盐水溶解,制备TXL-生理盐水混悬液,通过灌胃的方式给药；体外实验部分,用细胞基础培养基溶解制备成TXL储存溶液。2.实验动物模型的建立和分组100只12周龄雄性apoE-/-小鼠,高脂饮食1周后,随机分为生理盐水对照组(Control组,25只)和TXL干预组(75只)。为观察TXL的剂量效应,TXL干预组又分为TXL低剂量组(TXL-L,0.38g/kg/d,25只),TXL中剂量组(TXL-M, 0.75g/kg/d,25只)和TXL高剂量组(TXL-H,1.5g/kg/d,25只)。Control组给予相同体积的生理盐水。TXL干预5周后,所有小鼠行安乐死,留取各组小鼠血液及组织标本。3.血液学指标检测采用酶法分别检测各组小鼠的血清甘油三酯(triglycerides, TG)、总胆固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白胆固醇酯(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇酯(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)以及血糖水平。4.主动脉环出芽实验在I型鼠尾胶原中培养各组小鼠的胸主动脉环,观察TXL干预对小鼠胸主动脉环出芽的影响。5.组织标本病理学检测对主动脉行大体油红O染色,主动脉根部连续切片分别行苏木素-伊红(H&E)染色,油红O染色,饱和苦味酸-天狼猩红染色及免疫组织化学染色。测量主动脉斑块负荷,主动脉根部斑块横断面面积、斑块最大内膜厚度、斑块内脂质、胶原、巨噬细胞、平滑肌细胞、VEGF-A、ANGPT-1和ANGPT-2的含量百分比,统计VV数,计算斑块ANGPT-1/ANGPT-2的含量百分比的比值。6.相关性分析进行斑块外膜VV数与斑块横断面面积及斑块内VEGF-A、ANGPT-1、 ANGPT-2的表达以及ANGPT-1/ANGPT-2的含量百分比的比值间的相关性分析。7.组织标本分子生物学检测提取各组小鼠的主动脉蛋白,Western Blot检测各组小鼠主动脉斑块内VEGF-A、ANGPT-1和ANGPT-2在蛋白水平的变化,并计算各组小鼠ANGPT-1与ANGPT-2的蛋白比值。8.细胞培养小鼠巨噬细胞株RAW264.7购买于美国ATCC公司,于含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的高糖DMEM培养基培养,常规方法传代。9.体外实验细胞分组及干预为了探讨TXL溶液对炎性状态下巨噬细胞血管新生因子表达的影响及可能的作用机制,RAW264.7细胞分为TNF-a刺激组和TXL干预组。10.实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)收集不同干预的巨噬细胞,提取mRNA,采用实时荧光定量PCR方法检测各组细胞中VEGF-A、ANGPT-1和ANGPT-2指标在RNA水平的变化。采用2-△△CT方法计算,以GAPDH为内参照基因。11.蛋白质印迹法(Western Blot)收集不同干预的巨噬细胞,提取蛋白,采用Western Blot方法检测各组细胞中VEGF-A、ANGPT-1、ANGPT-2、PI3K、p-Akt、Akt、HIF-1α和Ets-1指标在蛋白水平的变化。采用Photoshop软件分析条带的平均密度值和面积,以GAPDH为内参照蛋白。12.统计分析方法所有实验数据均以均数±标准误表示。所有统计学分析均采用GraphPad Prism 5统计软件进行。两组间比较采用独立t检验,多组间的比较采用One-way ANOVA统计方法,各组间比较采用Tukey post-hoc检验。P<0.05被认为有统计学意义。研究结果1. apoE-/-小鼠的基本情况实验结束时,所有小鼠均顺利通过实验。各组间小鼠体重无显著性差异。血液学检测指标包括血清TG、TC、LDL-C、HDL-C以及血糖水平,在各组小鼠间比较无统计学差异。2.TXL对主动脉环出芽及AS斑块VV增生的影响离体主动脉环出芽实验表明,与Control组相比,TXL-L、TXL-M、TXL-H组小鼠主动脉环出芽的数量和新生血管的长度均显著减少。体内实验,利用Tomato lectin灌注后,以免疫组织化学染色法显示血管内皮,与Control组相比,TXL-L、TXL-M、TXL-H组AS斑块外膜的VV增生均显著受到抑制。3.TXL对AS斑块内血管新生因子表达的影响免疫组织化学染色及Western Blot检测均显示,与Control组相比,TXL-L、 TXL-M、TXL-H组斑块内VEGF-A蛋白的表达水平均显著减少,ANGPT-1蛋白的表达水平显著升高,而ANGPT-2蛋白的表达水平无显著统计学差异,因此,ANGPT-1与ANGPT-2蛋白表达的比值在各TXL干预组斑块内显著升高。4.TXL对AS斑块负荷、斑块横断面面积及内膜厚度的影响大体油红O染色检测各实验组小鼠主动脉斑块负荷。与Control组相比,TXL干预能剂量依赖性地降低斑块负荷。H&E染色观察斑块形态,测量斑块横断面面积及斑块最大内膜厚度。与Control组相比,各TXL剂量干预组的斑块横断面面积均显著减小,但斑块的最大内膜厚度在各组小鼠间比较无统计学差异。5.TXL对AS斑块组织成分的影响组织病理学染色结果显示,与Control组相比,各TXL剂量干预组均能显著减少斑块内脂质及巨噬细胞的含量百分比,显著增加斑块内平滑肌细胞及胶原的含量百分比。6.相关性分析相关性分析显示VV与斑块横断面面积及斑块内VEGF-A的表达呈正相关(r=0.900, p<0.01;r=0.891, p<0.01),与ANGPT-1的表达呈负相关(r=-0.821,p<0.01),而与ANGPT-2的表达呈正相关(r=0.805,p<0.01),但是与ANGPT-1/ANGPT-2含量百分比的比值呈负相关(r=-0.849,p<0.01)。7.TXL溶液对炎性状态下巨噬细胞血管新生因子表达的影响qRT-PCR和Western Blot实验结果均显示,与TNF-a刺激组相比,TXL溶液能剂量依赖性的抑制巨噬细胞中VEGF-A并增加ANGPT-1在mRNA和蛋白水平的表达,而对ANGPT-2的mRNA和蛋白的表达水平没有显著影响。因此,ANGPT-1与ANGPT-2蛋白表达的比值在TXL溶液干预组显著增加。8.TXL溶液对巨噬细胞中PI3K/Akt/HIF-la信号通路及ANGPT-2转录因子Ets-1蛋白表达的影响Western Blot检测显示,TNF-α刺激使得PI3K、p-Akt、HIF-1α以及Ets-1的蛋白表达水平升高,TXL溶液预处理可有效抑制TNF-α诱导的PI3K/Akt/HIF-1α信号通路的激活,但对Ets-1蛋白的表达无显著性影响。研究结论1.TXL干预抑制VV增生可能是其抑制AS早期病变的形成及改善斑块组织成分的作用机制之一；2.TXL干预抑制VV增生的作用可能与调节斑块内血管新生因子的表达有关；3.TXL干预对血管新生因子的调控可能与抑制PI3K/Akt/HIF-1α信号通路有关。研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是大、中动脉血管壁的一种慢性、全身炎症反应性疾病的概念已被人们广泛接受。炎症反应贯穿AS病变发展的各个时期：在脂质条纹形成早期,活化的血管内皮细胞分泌趋化因子及表达粘附分子招募循环中单核细胞迁移、浸润至内皮细胞下成为定居的巨噬细胞；斑块内活化的炎症细胞分泌金属基质蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)降解细胞外基质和纤维帽,导致斑块破裂及血栓形成进而引起临床不良事件的发生。多年来炎症对AS斑块进展的研究多集中于其介导的固有免疫和适应性免疫反应,而近年来越来越多的研究表明炎症在斑块内血管新生增加AS斑块易损性的过程中扮演着重要角色。AS易损斑块的病理组织学特征为大的偏心脂质核心、薄的纤维帽、活跃的炎症反应、血管正性重构、斑块内大量血管新生及滋养血管(vasa vasorum, VV)增生等。近期的影像学研究表明,在发生急性冠脉综合征的病例中大多伴有近期内斑进展速率增加的现象。斑块迅速增大的可能机制为：1)未导致临床心血管事件的斑块的反复破裂与修复；2)斑块内新生血管的渗漏导致富含胆固醇的红细胞膜在斑块内堆积及炎症加剧；3)斑块内新生血管的破裂导致斑块体积增大、胆固醇积聚和氧化应激加剧。斑块内炎症细胞所分泌的炎症因子及MMPs能够直接或者间接地促进血管新生,而新生血管的内皮细胞表面粘附分子呈高水平表达,缺少支持细胞覆盖,与细胞外基质间连接疏松,导致血管通透性增加,致其成为炎症细胞、红细胞、脂质成分等进入病变的另一通道。斑块内炎症与血管新生相互促进,形成了正反馈机制,加速了AS的进程,增加了斑块易损性。鉴于炎症与血管新生间的密切联系,学者们提出了“炎症性血管新生”的概念以更好地描述血管新生与炎症性疾病之间的关系。肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor alpha, TNF-a)是一种多效性的炎症因子,能够强烈促进粘附分子、MMPs、纤溶酶原激活物抑制物等的表达,调节细胞死亡,对AS发生和发展发挥着重要的促进作用。尽管体外细胞研究中发现高浓度的TNF-α能够抑制内皮细胞的增殖,但低浓度的TNF-α却能够通过激活X染色体上的骨髓激酶(bone marrow kinase in chromosome X, BMX)、核因子Kappa B (nuclear factor Kappa B, NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)等多种通路促进内皮细胞的迁移和体外微血管生成。鸡胚绒毛尿囊膜模型、兔眼角膜微囊模型及小鼠下肢缺血模型等多个体内研究也证实了TNF-α促进血管新生的能力。在本论文第一部分的研究中,我们发现早期应用中药通心络(Tongxinluo, TXL)能够通过调节斑块内血管新生相关因子的表达抑制斑块外膜VV增生进而抑制早期斑块的形成,但是TXL对斑块内已经形成的VV增生和进展期斑块内血管新生以及炎性状态下内皮细胞血管新生能力的影响仍不明确。因此,本研究拟在高脂喂养的载脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E deficient, apoE-/-)小鼠AS进展期斑块模型中,观察TXL对进展期斑块内炎症性血管新生及斑块稳定性的影响,并在体外实验中探究TXL溶液对炎症因子TNF-α诱导的内皮细胞血管新生的影响及可能的作用机制。研究目的1.观察TXL对apoE-/-小鼠AS进展期斑块中已经形成的VV增生、斑块内血管新生及斑块稳定性的影响；2.观察TXL溶液对炎性状态下内皮细胞血管新生的影响；3.探讨TXL干预影响炎症性血管新生的可能机制。研究方法1.实验动物模型的建立和分组100只10周龄雄性apoE-/-小鼠,高脂饮食20周后,随机分为生理盐水对照组(Control, n=25), TXL低剂量组(TXL-L,0.38g/kg/d, n=25),TXL中剂量组(TXL-M,0.75g/kg/d, n=25)和TXL高剂量组(TXL-H,1.5g/kg/d, n=25); Control组给予相同体积的生理盐水。所有apoE-/-小鼠全程高脂饮食,TXL干预16周后,小鼠行安乐死,留取各组小鼠血液及组织标本。2.血液学指标检测实验结束末,检测各组小鼠血清甘油三酯(triglycerides, TG)、总胆固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白胆固醇酯(low-density lipoprotein cholesterol? LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇酯(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)以及血糖水平。3.组织标本病理学检测对主动脉行大体油红O染色分析斑块负荷。主动脉根部连续切片分别行苏木素-伊红(Hematoxylin and eosin, H&E)染色、油红O染色以及苦味酸-天狼猩红特殊染色以观察斑块形态,检测主动脉根部斑块横断面面积及斑块内脂质、胶原含量百分比。免疫组织化学染色检测斑块内巨噬细胞(MOMA-2)、平滑肌细胞(a-SMA)、VV及斑块内新生血管内皮细胞(Tomato lectin染色)、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)、炎症因子TNF-α、白介素1β(Interlukine 1β, IL-1β)、IL-6.血管内皮细胞生长因子A (vascular endothelial growth factor A, VEGF-A)及MMP-2的表达。采用以下公式计算斑块易损指数,斑块易损指数=(脂质+巨噬细胞)含量百分比／(胶原+平滑肌细胞)含量百分比。4.相关性分析对斑块外膜VV数及斑块内新生血管数与主动脉根部横断面面积及斑块内趋化因子MCP-1、炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)及血管新生因子(VEGF-A、 MMP-2)进行相关性分析。5.组织标本分子生物学检测提取各组小鼠主动脉蛋白,Western Blot检测各组小鼠主动脉斑块内MCP-1、 TNF-α、IL-1β、IL-6、VEGF-A及MMP-2在蛋白水平的变化。6.体外研究采用原代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)及人单核细胞THP-1细胞株。为观察TXL溶液在炎症状态下对血管新生的影响,细胞实验分为：空白对照组(不加TNF-α、TXL)、TNF-α对照组(只加TNF-α,无TXL)和TXL溶液干预组(TNF-α+不同浓度TXL溶液)。TNF-α在培养基中的终浓度为lng/ml。7.CCK-8细胞活力检测采用CCK-8试剂检测不同浓度的TXL溶液(0、25、50、100、200、500、1000μg/ml)对内皮细胞活力的影响。8.内皮细胞迁移能力检测分别采用划痕实验和Transwell小室迁移实验来观察TXL溶液对TNF-α诱导的内皮细胞迁移的影响。9.体外血管生成实验于含低生长因子基质胶(Matrigel)中,观察TXL溶液对TNF-α诱导的内皮细胞体外血管生成的影响。10.内皮-单核细胞粘附实验用BCECF-AM荧光探针标记THP-1细胞,观察TXL溶液对TNF-α诱导的内皮-单核细胞间粘附的影响。11.细胞免疫荧光实验细胞免疫荧光观察TXL溶液对TNF-α诱导的NF-κB p65细胞核转位的影响。12. Western Blot检测Western Blot法检测TXL溶液对TNF-α诱导的HUVEC的细胞间粘附蛋白-1(intercellular adhesion molecule, ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、BMX, NF-κB及MAPK家族信号通路蛋白的影响。13.统计学分析实验数据以均数±标准误表示。所有统计学分析均采用GraphPad Prism 5统计软件进行。多组间的比较采用One-way ANOVA统计方法,其下的各组间比较采用Tukey post-hoc检验。P<0.05被认为有统计学意义。研究结果1.各组小鼠一般状况观察实验结束时,共有10只小鼠死亡,其中Control组小鼠死亡3只,TXL-L组死亡3只,TXL-M组及TXL-H组各死亡2只。小鼠体重在各组间无统计学差异,血脂四项以及血糖水平在四组小鼠间均未有统计学差异。2.TXL干预对斑块外膜滋养血管增生及斑块内血管新生的影响与Control组相比,TXL各剂量干预组均能够显著减少斑块外膜VV增生及斑块内血管新生,并且这一抑制作用呈剂量依赖性。3.TXL干预对斑块负荷及主动脉根部斑块横断面面积的影响大体油红O染色及H&E染色显示,与Control组相比,TXL干预能剂量依赖性地减小斑块负荷及斑块的横断面面积。4.TXL干预对斑块组织成分及稳定性的影响与Control组相比,斑块内脂质及巨噬细胞含量百分比在各剂量TXL干预组均显著降低,而斑块内胶原及平滑肌细胞含量百分比在TXL各剂量干预组显著升高；计算的易损指数在TXL各剂量干预组也相应的明显减小。5.通心络干预对斑块内趋化因子及炎症因子表达水平的影响免疫组化染色与Western Blot检测结果均显示,与Control组相比,TXL各剂量干预组均能显著减少斑块内趋化因子MCP-1及炎症因子TNF-α、IL-1β及IL-6的蛋白表达水平,减轻斑块内炎症反应水平。6.通心络干预对斑块内血管新生相关因子表达水平的影响免疫组化染色与Western Blot检测结果均显示,与Control组相比,TXL各剂量干预组能剂量依赖性地减少斑块内VEGF-A及MMP-2的蛋白表达水平。7.相关性分析相关性分析显示斑块外膜VV数与斑块横断面面积(r=0.891,p<0.01)、斑块内MCP-1(r=0.952,p<0.01)、炎症因子TNF-a(r=0.915,p<0.01)、IL-1β(r=0.841, p<0.01)、IL-6 (r=0.870,p<0.01)及血管新生因子VEGF-A (r=0.931, p<0.0)和MMP-2的含量百分比(r=0.940,p<0.01)均呈正相关。斑块内新生血管数量与斑块横断面面积(r=0.903,p<0.01)、斑块内MCP-1含量百分比(r=0.955,p<0.01)、炎症因子TNF-a(r=0.930,p<0.01)>、IL-1β(r=0.853,p<0.01)、IL-6 (r=0.899, p<0.01)及血管新生因子VEGF-A (r=0.924, p<0.01)和MMP-2 (r=0.935, p<0.01)均呈正相关。8.TXL溶液对HUVEC细胞活力的影响CCK-8细胞活力实验显示,随着TXL溶液浓度的增加,HUVEC的细胞活力降低,TXL溶液浓度增至1000μg/ml时细胞活力降为49.79%。9.TXL溶液对TNF-α诱导的炎症性血管新生的影响采用细胞划痕和Transwell小室迁移两种检测细胞迁移的方法均证明,TXL预处理能显著抑制TNF-α诱导的内皮细胞的迁移。Matrigel体外成管实验结果显示,TXL溶液预处理能显著抑制TNF-α诱导的体外内皮细胞形成小管的总长度。TNF-α刺激使内皮细胞表面粘附分子表达水平升高,招募单核细胞增多。荧光图像分析显示,TXL溶液预处理能显著减少TNF-α诱导的内皮-单核细胞间的粘附。并且Western Blot检测结果显示,TXL溶液预处理能明显减少TNF-α诱导的内皮细胞表面粘附分子ICAM-1及VCAM-1的蛋白表达水平。10.TXL溶液抑制TNF-α诱导的炎症性血管新生的机制研究Western Blot检测结果显示,TNF-α刺激能够激活内皮细胞内BMX,使得BMX磷酸化水平升高,TXL溶液预处理能显著抑制TNF-α诱导的BMX的磷酸化。免疫荧光检测结果显示,TXL溶液预处理能明显抑制TNF-α诱导的NF-κB的细胞核转位；与细胞免疫荧光检测结果一致,Western Blot检测显示,TXL溶液预处理可以显著减少TNF-a诱导的NF-κB p65的磷酸化水平。TNF-a刺激能够激活内皮细胞内MAPK信号通路,引起细胞内JNK、p38及ERK1/2的磷酸化水平升高。TXL溶液预处理后能显著抑制TNF-a诱导的JNK,p38的磷酸化水平,但对ERK1/2的磷酸化无显著影响。研究结论1.进展期斑块中炎症及血管新生因子的高表达可能是促进斑块血管新生的主要机制；2.TXL干预抑制斑块炎症性血管新生可能是其减小进展期斑块负荷和增加斑块稳定性的作用机制；3.TXL干预能够抑制TNF-α诱导的内皮细胞的迁移、体外成管及内皮与单核细胞间的粘附能力；4.TXL抑制炎症性血管新生的作用可能是通过抑制BMX、NF-κB的磷酸化及MAPK信号通路中JNK和p38的活化而实现的。