研究背景外阴阴道假丝酵母菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)是一种常见外阴阴道炎症。VVC大约占有症状感染者的17%-39%,约占微生物所致阴道炎的25%-30%；其中5%-8%的VVC患者发展为复发性外阴阴道假丝酵母菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis, RVVC),即一年内VVC发作4次或以上。外阴阴道假丝酵母菌病的致病菌以白假丝酵母菌(Candida albicans,C.albicans)为主,约占60%,其他非白色假丝酵母菌也占相当比例。假丝酵母菌寄居于阴道粘膜,它与乳酸杆菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌等定植菌构成阴道正常菌群,菌群之间存在共生及拮抗的关系,共同形成一个动态的平衡。细菌丛能抵抗假丝酵母菌的生长,阴道粘膜预防真菌侵入,阴道内寄生的厌氧菌和乳酸菌对阴道上皮细胞有保护作用。正常情况下,定植的假丝酵母菌不会引起任何不适,但当女性生殖道内的微生态菌群受到环境变化、药物刺激、宿主的激素水平和免疫状态低下等因素的影响,平衡状态被打破,优势繁殖的假丝酵母菌引起假丝酵母菌性阴道病。阴道内的微生态平衡状态改变,是VVC发生的重要原因之一。而假丝酵母菌是一种二态共栖真菌,容易受外界环境影响而发生变异,故阴道真菌菌群具有高度多样性,其结构的改变与RVVC发生发展有相互关系。早期研究主要集中在假丝酵母菌的菌种培养及药敏情况,较少分析阴道微生态菌群的整体构成与其在疾病的发生发展和转归中的变化情况。因此,了解VVC及RVVC患者的阴道微生态菌群结构及动态变化,有利于我们了解生殖道假丝酵母病的发生、发展过程,进一步指导临床治疗及预防复发。阴道菌群主要为厌氧菌,使用传统培养和分离鉴定的方法难以全面认识多样性的阴道菌群构成。随着分子生物学技术的迅速发展,非培养依赖性技术逐渐成熟,研究者可以利用16S rRNA基因聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增这种阴道微生物的非培养法,通过Illumina Solexa高通量测序平台测序、结合带标签的基于荧光测序平台的双末端测序(Barcoded Paired-End Illumina Sequencing, BIPES),可快速、全面了解阴道微生物群落结构信息。目前已有相关报道阐明了健康受试者和假丝酵母菌病患者阴道微生物群落菌群组成及其多样性变化。然而,对假丝酵母菌病患者积极治疗前后其阴道微生物群落菌群的整体结构、组成及变化,至今仍然没有深入的研究。欲从病因上达到假丝酵母菌病治愈的目的,这仍需通过全面了解疾病状态下女性生殖道菌群结构及多样性变化,对临床治疗与阴道微生态变化的相关性进一步深入研究。研究目的1、通过Illumina高通量测序技术及BIPES的序列研究方法,了解WC和RVVC患者治疗前后阴道微生物菌群的结构,分析阴道菌群的多样性改变,了解治疗药物对WC和RVVC患者阴道菌群改变的差异,探讨菌群的改变与治疗效果的相关性。2、追踪观察VVC和RVVC患者在第二观察月经周期中(为非发病周期)与原治疗前后相对应月经周期日的阴道菌群结构信息,了解月经周期、疾病因素与患者阴道菌群的相关性,探讨假丝酵母菌病的发生、康复与菌群结构改变的相关性。方法1.实验对象：实验一：2013年4月-2013年12月就诊于佛山市顺德区第一人民医院妇科门诊的患者6例,平均年龄(30.16±6.66)岁。患者均签署知情同意书。VVC组(3例)纳入标准：①症状：外阴瘙痒、灼痛,可伴有性交痛、尿痛、阴道分泌物增多等；②体征：外阴潮红、水肿,可伴抓痕或皲裂,小阴唇内侧及阴道粘膜潮红,附着白色膜状物；阴道内可见白色粘稠呈乳胶或豆渣样分泌物；③实验室检查：湿涂片(以生理盐水和10%KOH制备)证实存在假丝酵母菌的芽生孢子或假菌丝；或真菌培养培养有白假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌等生长。RVVC组(3例)纳入标准：①符合VVC诊断标准,并在一年内有症状并经真菌学证实的VVC发作4次或以上。②实验室检查：湿涂片(以生理盐水和10%KOH制备)证实存在假丝酵母菌的芽生孢子或假菌丝；或真菌培养培养有白假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌等生长。两组患者确诊后予盐酸特比萘芬阴道泡腾片治疗(阴道内用药,50 mg/d,共7d),治疗结束后,患者均自觉外阴瘙痒症状缓解、白带减少,实验室湿涂片检查真菌阴性。实验二：实验一中所选取的6例观察对象,分别纳入WCⅡ组、RVVCⅡ组,以非发病期所在月经周期为第二观察周期。纳入标准同实验一。患者均签署知情同意书。排除标准：研究对象月经规则,为非妊娠期、哺乳期；排除全身系统性疾病如：糖尿病、激素治疗性疾病(如急慢性肾炎)等；排除其他阴道炎如：滴虫性、细菌性阴道病等；1个月内无全身应用抗生素、免疫抑制剂、阴道用药史,3天内无性生活史及阴道灌洗。2.标本采集实验一研究对象于发病期用药前及用药第8天取材,而实验二研究对象于非发病期中与药物治疗前后相对应的月经周期日取材。用无菌阴道拭子于阴道穹窿处阴道壁取分泌物。将阴道拭子置于无菌干燥试管中,用于提取细菌总DNA。标本采集后放于4℃标本箱保存送检。3.细菌总DNA的提取与检测 以细菌基因组DNA提取试剂盒提取样本中总DNA,具体操作步骤参照说明书。提取的总DNA经紫外分光光度计(波长为570)测定纯度和浓度,PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后放置4℃冰箱中保存备用。4.16s rRNA V4区基因片段的扩增及Illumina测序以样本总DNA为模版,采用引物(上海生工生物工程股份有限公司)514F和805R,扩增其中的16s rRNAV4区基因。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测产量和特性,经回收纯化后,通过Illumina Hiseq2000平台进行双末端100 bp测序(华大基因,深圳)。5.生物信息学分析所测得的序列经过BIPES操作进行初步处理,保留有效测序数据进行修剪；反向互补组装V4序列；使用两阶段聚类(Twostage-cluste ring, TSC)进行聚类,提取出每个操作分类单元(operational taxonomy units, OTU)的代表序列后利用全局比对序列分类(Global alignment -for sequence taxonomy, GAST)进行物种的分类,其中属于乳酸菌属的OTU利用Blast进一步分到种级别,基于进化关系分析细菌群落结构距离(Unifrac Distance),采用微生物生态学定量研究(Quantitative Insights Into Microbial Ecology, QIIME)进行阴道菌群主成分分析。6.统计学处理 应用SPSS13.0软件进行统计分析,计数资料采用率(%)或构成比表示,组间比较采用x2检验；计量资料以均数±标准差(x±s)表示,组内或组间比较采用方差分析；P<0.05为差异有统计学意义。结果实验一：1.测序数据采用BIPES流程进行分析,采用UCHIME去除嵌合体序列,本实验测序样品数12个,共获得928028条序列,平均每个样品77340条。2.应用全联聚类(Complete linkage)的方法对VVC组和RVVC组的阴道菌群进行聚类分析。VVC组和RVVC组阴道微生态优势菌群多样性未能以疾病分组显著区分,而是以个体菌群为特征聚类。VVC组用药后菌群较用药前差异明显,而RVVC组用药后菌群与用药前菌群结构更相似。说明菌群以个体为单位聚类,用药前后的样品菌群相似度大于疾病的影响。3.应用欧式距离(Euclidean distance)展示VVC组和RVVC组阴道菌群用药前后的差异。VVC组用药后的菌群变化幅度较大,RVVC组用药后菌群差异较小或不变,两组差异有统计学意义(P<0.05)。4.在属水平分析VVC组和RVVC组用药前后菌属构成比的差异。显示VVC组用药前双歧杆菌、惰性乳杆菌、加德纳菌比例较高,分别占各自标本的80%、55%、45%,用药后菌群中原优势菌的比例降低约15%～55%,乳酸菌丰度增加成为优势菌,个体治疗前后的差异存在统计学意义(P<0.05)。而药物治疗后RVVC组菌属构成比基本一致,个体治疗前后的差异无统计学意义(P>0.05)。5.以OTU的个数测定(Observed-species)(a)、赵氏菌种丰富度指数(Chaol)(b)、谱系多样性(PD-whole-tree)(c)和香农指数(Shannon Index)(d)四个指标分析,展示VVC组和RVVC组用药后阴道菌群的a-多样性未发生显著变化。(p均>0.05)。6.通过LEfSe统计两组菌属差异表明,未发现VVC组和RVVC两组用药前后存在差异性菌属。实验二：1.测序数据采用BIPES流程进行分析,采用UCHIME去除嵌合体序列,本实验测序样品数12个,共获得929032条序列,平均每个样品77420条。2.应用全联聚类(Complete linkage)的方法对VVCⅡ组和RVVCⅡ组的阴道菌群进行聚类分析。VVCⅡ组和RVVCⅡ组阴道微生态优势菌群多样性仍以个体菌群为特征聚类,VVCⅡ组菌群存在多样性变化,RVVCⅡ组菌群结构无显著变化。两组阴道微生态优势菌群的差异不显著(P=0.465)。3.在属水平分析VVCⅡ组和RVVCⅡ组菌属构成比的差异。每例患者分别采集了用药前同期(第一个图柱)和用药后同期(第二个图柱)的样品,分析了VVCⅡ组和RVVCⅡ组在非发病观察期用药前后同期的阴道菌群菌属,从属水平对两组菌属构成比差异进行分析。VVCⅡ组和RVVCⅡ组个体用药前后同期的差异不显著,说明非发病期VVC患者及RWC患者的优势菌群相似,阴道内微生态处于相似稳定状态。4.在属水平分别分析VVC组和VVC Ⅱ组、RVVC组和RVVCⅡ组菌属构成比的差异。每例患者分别采集了用药前(第一个图柱)、用药后(第二个图柱)、用药前同期(第三个图柱)和用药后同期(第四个图柱)的样品,分析了VVC组、RWC组患者在发病期和非发病期同期的阴道菌群菌属,分别对两组菌属构成比差异进行分析。VVC Ⅱ组与VVC组优势菌群差异存在显著变化(P=0.012),而RWCⅡ组与RVVC组菌群差异仍较相似(P=0.541)。说明假丝酵母菌病的偶然发生可以干扰阴道菌群的平衡；当反复发作时,假丝酵母菌病与阴道微生物群落优势菌之间的相关性则明显减弱。结论1.抗菌药物杀灭假丝酵母菌属菌同时,降低了假丝酵母菌对乳杆菌的拮抗作用,从而调整了阴道菌群的结构,使菌群结构逐渐趋向于正常。抗真菌药物治疗并非促使患者出现新的菌属,而是调节阴道菌群自身内部的构成,恢复菌群平衡状态达到治疗效果。2.VVC组和RVVC组阴道微生态优势菌群多样性是以个体菌群为特征聚类。VVC组对药物治疗较敏感,而对RVVC患者的治疗并未引起阴道微生态的明显变化。两组非发病期患者的阴道微生物优势菌群与发病期比较,VVC组有显著差异,而RVVC组无明显差异,说明假丝酵母菌病的偶然发生可以干扰阴道菌群的平衡；当反复发作时,假丝酵母菌病与阴道微生物群落优势菌之间的相关性则明显减弱。