烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)在各种细胞生理过程中起着至关重要的作用,对基因表达、DNA修复、钙离子动员、应激、凋亡、代谢、增殖、老化、寿命、内分泌等方面表现出深刻的影响,NAD的生物能量状态甚至决定了细胞的生死存亡,因而参与NAD生物合成和代谢的酶也成为各种疾病的药物发现中极具吸引力的靶标。在哺乳动物中,Nampt和Nmnat是重要的NAD合成酶,烟酰胺NAM在Nampt催化作用下转化为烟酰胺单核苷酸NMN,随后NMN在Nmnat作用下合成NAD。哺乳动物细胞中80%的NAD由该途径合成。我们的实验证明,BL21-CondonPlus (DE3)-RIL为Nmnat表达适宜的宿主菌,可显著改善Nmnat在大肠杆菌系统的表达效率。进一步对其诱导表达的温度、时间、IPTG浓度以及培养基的考察,确定了Nmnat重组蛋白表达的最优条件:在2×YT培养基(37ug/ml氯霉素和75ug/ml卡那霉素)中于28℃、0.5mM IPTG诱导8h。利用Ni-NTA亲和层析柱纯化并获得具有较高纯度的目的蛋白,通过酶联荧光法测得Nmnat具有较好的酶活性。Nmnat的酶活性在肿瘤化学治疗、能量代谢和信号通路中起重要作用,然而目前极少有Nmnat的酶活性调控分子报道。该部分的工作为我们筛选Nmnat的活性调控分子奠定了一定基础。Nampt是哺乳动物NAD生物合成途径的限速酶,具有促血管生长、抗细胞凋亡、参与机体炎症应答、促进多种细胞分化成熟等生理功能,是防治心脑血管疾病、癌症的新靶标。我们从原核大肠杆菌系统中成功表达并纯化得到Nampt重组蛋白,并建立了Nampt酶活性检测方法。酶产物NMN经过两步简单的化学反应转化为有荧光的衍生物,可在激发波长382nm、发射波长445nm检测到最大荧光信号。通过对检测反应各步骤的反应温度、时间,以及一系列Nampt酶学特性的分析,优化Nampt的活性检测方法,建立了Nampt的高通量筛选模型。模拟高通量筛选过程,统计数据表明加样过程整块96孔板的CV值为3.0%<10%,同时评估了筛选体系Z′factor为0.668>0.5,说明筛选过程合格,满足高通量筛选要求。为验证该筛选模型,我们对本实验室现有的包括Nampt抑制剂FK866在内的84个小分子化合物进行初筛,通过设计对照反应组进行复筛排除假阳性结果,确定FK866、zl-1、zl-3和单宁酸为有效的活性化合物,进一步测定它们的半抑制常数IC50值依次为0.9nM、17.8uM、6.72uM和1.3uM。高通量筛选是新药发现的重要手段之一,我们首次建立了Nampt酶活性筛选平台,期望利用该平台筛选出有效的Nampt酶活性调控分子,为癌症、脑卒中防治的新药研发提供先导化合物,促进Nampt的基础医学研究;同时为Nampt酶调控研究提供探针分子,促进Nampt的生理功能研究。