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本文将人工合成的BYDV-GPV株系复制酶基因ORF1和ORF2 cDNA片段正向串联到了植物表达载体pWubi.tm1质粒上，成功地构建了植物表达载体pPPI29，利用花粉管通道法和基因枪法分别转化了普通小麦品种陇鉴127、CA8686、京冬8号和扬麦158，并进行了部分转基因小麦的抗病性鉴定；探讨了植物激素对成熟胚愈伤组织诱导的影响，获得了较高成熟胚愈伤组织的优化培养基配方：并对ORF1和ORF2基因进行了原核表达。 研究结果为： 根据已经测定的BYDV-GPV部分序列，设计并合成ORF1和ORF2相应的上、下游引物，在引物中分别引入BamHI、KpnI和EcoRI位点，使得ORF1 5′端BamHI、3′端含有KpnI位点，ORF2基因5′端含有KpnI、3′端含有EcoRI位点，以BYDV-GPV株系病毒RNA为模板，RT-PCR分别扩增了GPV株系的ORF1和ORF2基因片段，并将其分别插入到pGEM-T-vector载体中，获得重组质粒pGEMORF1和pGEMORF2；将pGEMORF1和含有植物特异性表达启动子ubiquitin和终止子tm1的pWubi.tm1用BamHI和KpnI双酶切、回收，使回收的pWubi.tm1和ORF1片段连接成重组质粒pWORF1；然后用KynI和EcoRI双酶切pWORF1和pGEMORF2，并回收pWORF1（7.553kb）和ORF2（1.875kb），同样进行连接、转化和鉴定得到植物表达载体pPPI29（9.428kb），用于小麦的遗传转化。 利用基因枪轰击扬麦158愈伤组织1652个，经过双丙氨膦筛选，获得65株抗性小麦，经过分子检测共获得6株转基因植株，转化率为0.36%。 利用花粉管通道法共转化3个小麦品种（陇鉴127、CA8686和京冬8号），3671朵小花，收获2577粒种子，将收获的种子分别播种于温室（于4℃冰箱中春化21天）和田间，进行检测。分子检测结果表明，检测到6株CA8686阳性材料，其转化效率为0.42%；1株陇鉴127阳性结果，其转化效率为0.1%；京冬8号没有检测到阳性后代。对T0代部分转基因材料在田间进行抗病性鉴定，CA8686转基因小麦表现出具有对GPV株系的高度抗性，在对照植株严重发病时不表现症状或仅出现轻微的叶尖发黄症状，抗病性鉴定与分子检测结果一致；陇鉴127转基因系可达到减轻症状的效果，在对照下部叶片全部黄化时，下部叶片仍没有表现出严重症状，仅表现轻微症状。 采用二次正交旋转组合试验设计，探讨了2，4-D、肌醇和激动素对陇鉴127和陕160小麦成熟胚的愈伤组织诱导率的影响。结果表明，肌醇浓度对于小麦成熟胚愈伤组织的贡献率最大，其次为2，4-D，再次为激动素，并建立了适合两个小麦品种愈伤组织诱导率的数学模型，筛选出了适合两个小麦品种成熟胚愈伤组刘太国 摘 要2003年6月织诱导的最佳配比培养基配方。适合陇鉴 127小麦成熟胚愈伤组织诱导的培养基配方为：1．57～1．91m旮L的2，4－D、0．79～l＊Zing／L 的激动素和0．104～0．1259／L的肌醇；适合陕 160 ，J’麦成熟胚愈伤组织的诱导的培养基配方为：2刀8～2．40mg／L的二，4D、0．933～1．267mg／L的激动素和 0＊99～0．112g／L的肌醇。 构建了BYDVGPV株系复策酶基因的原核表达载体pETOgyl 和pETOgyZ，并进行了融合蛋白的初步表达，结果 ORF基因有特异性的蛋白产物得到初步表达，而ORFZ基因没有特异性蛋白表达。