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研究背景卵巢癌是威胁女性健康最致命的疾病之一,其死亡率居妇科恶性肿瘤之首。化疗是卵巢癌的主要治疗手段之一。顺铂作为一线化疗药物毒副作用大,并且单独用药的前提下只有5-10%能进入细胞与DNA交联发挥作用,所以如何提高肿瘤细胞对顺铂的摄取率问题急需解决。此外,卵巢癌的治疗过程中无法“可视”监控,不能实时评估治疗效果及时调整治疗方案是现代医学发展的缺憾。因此,改善顺铂的剂量依赖性毒性、实现可视化疗效评估是卵巢癌治疗中亟待解决的两大问题。本课题拟构建一种安全有效的载Pt（Ⅳ）配合物靶向纳米超声造影剂,即脂质-聚合物复合壳包载谷胱甘肽（GSH）响应型Pt（Ⅳ）前药的肿瘤靶向纳米相变超声造影剂。方案设计GSH响应型前药的设计:将顺铂转变为Pt（Ⅳ）,其轴向配体与DSPE-PEG1k-NH2的氨基共价结合,形成Pt（Ⅳ）前药(DSPE-PEG1k-Pt（Ⅳ）)。在外周循环中,前药的设计可以降低毒性,增加载药量并延长血浆半衰期。到达肿瘤部位后,借助磷脂自身特殊的两亲性结构,Pt（Ⅳ）前药易于穿过细胞膜,促进细胞摄取,随后在胞内还原性物质GSH作用下活化,释放有效Pt（II）复合物。因此,Pt（Ⅳ）前药能够增敏药物的抗肿瘤效果,同时降低化疗毒副作用。脂质-聚合物复合壳靶向纳米相变超声造影剂的设计:以PLGA12k-m PEG2k,PLGA12k-PEG2k-c RGD和DSPE-PEG1k-Pt（Ⅳ）三种材料为主体,形成脂质-聚合物复合壳,分别将全氟己烷液滴（PFH）和Pt（Ⅳ）前药包载在壳内和复合壳上。其中PFH在外界压力减小至气化压力阈值或温度升高至沸点以上时会发生液气相转变引起纳米粒的结构和形态变化,发挥显像的作用。复合壳具有聚合物壳的稳定结构,引入磷脂材料后减小聚合物壳硬度,降低相变所需要的声能,增强超声信号强度。复合壳上修饰聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG）可以避免纳米相变超声造影剂被网状内皮系统吞噬,延长造影剂的体循环时间,促进造影剂通过EPR效应（enhanced permeation retention effect,EPR effect）被动靶向至肿瘤组织中。因此,具有复合壳结构的纳米相变超声造影剂易响应超声刺激,能够改善超声显像效果和药物递送效率。此外,造影剂表面引入与整合素受体具有高亲和力的RGD环肽（c RGD）,可以实现肿瘤主动靶向给药,进一步增强抗肿瘤作用。研究内容和结果载Pt（Ⅳ）靶向纳米相变超声造影剂的构建和性能:本课题合成了Pt（Ⅳ）前药并制备了载Pt（Ⅳ）靶向纳米相变超声造影剂（Pt（Ⅳ）NP-c RGD）,通过单因素考察和正交设计优化了纳米粒的制备方法。Pt（Ⅳ）NP-c RGD的平均粒径为151.1±1.3 nm,电荷为-5.27±0.38 m V,分散性良好。稳定性评价结果显示,Pt（Ⅳ）NP-c RGD可分别在4℃、25℃和37℃的储存条件下稳定保存25天;血清稳定性检测表明其可以抵抗血清诱导的凝集反应,延长体内循环时间,提示载药纳米粒稳定性良好。相变特性考察发现,升温或超声可刺激PFH液滴发生相变,引起Pt（Ⅳ）NP-c RGD的形态和结构发生变化。体外药物释放实验证实,Pt（Ⅳ）NP-c RGD的药物释放呈现GSH浓度依赖性并且超声刺激能促进药物释放。此外,Pt（Ⅳ）NP-c RGD具有良好的体外超声显像效果。载Pt（Ⅳ）靶向纳米相变超声造影剂体外抗肿瘤作用:体外细胞学研究以SKOV3、A2780及整合素受体表达下调的SKOV3三种卵巢癌细胞作为研究对象,分别考察了Pt（Ⅳ）NP-c RGD在不同细胞中的摄取和细胞毒性。研究发现c RGD与肿瘤细胞表面高表达的整合素受体相互作用,促进纳米粒的摄取,增强Pt（Ⅳ）NP-c RGD对肿瘤细胞的杀伤作用。此外,以SKOV3细胞作为研究对象,进一步研究了超声联合Pt（Ⅳ）NP-c RGD对肿瘤细胞的摄取和活性的影响。激光共聚焦和流式细胞术结果显示,超声能够促进SKOV3细胞对Pt（Ⅳ）NP-c RGD的摄取。MTT试验和钙黄绿素染色结果表明,超声联合Pt（Ⅳ）NP-c RGD能显著抑制SKOV3细胞生长,增强体外抗肿瘤作用。载Pt（Ⅳ）靶向纳米相变超声造影剂体外抗肿瘤机制:对超声联合Pt（Ⅳ）NP-c RGD抑制SKOV3细胞生长的作用机制进行分析。结果显示,超声联合Pt（Ⅳ）NP-c RGD消耗胞内大量GSH,破坏细胞的氧化还原平衡,进而引起活性氧（ROS）水平上升。又因为超声刺激也会促进ROS产生,所以超声联合Pt（Ⅳ）NP-c RGD显著提高细胞内ROS浓度。同时研究结果表明,超声联合Pt（Ⅳ）NP-c RGD引起了超氧阴离子和一氧化氮等多种氧自由基的水平上升。进一步研究证实,胞内高水平ROS引起线粒体膜电位下降,线粒体膜通透性增加,位于线粒体内外膜之间的细胞色素C大量释放进入细胞质,启动caspase的级联反应,激活下游效应器caspase 3,最后诱导细胞凋亡。载Pt（Ⅳ）靶向纳米相变超声造影剂体内诊疗效果:血浆半衰期结果显示Pt（Ⅳ）NP-c RGD减少了肝、脾等单核吞噬系统的吞噬作用,延长了血液循环时间,有利于纳米粒通过EPR效应实现肿瘤的被动靶向。以SKOV3细胞裸鼠皮下移植瘤为模型,观察包载荧光染料的纳米粒在荷瘤裸鼠体内随时间的分布。随着循环时间延长,靶向组相较于非靶向组纳米粒在肿瘤部位富集增多,表明纳米粒具有显著的长循环特性并且能够主动靶向肿瘤组织。超声联合Pt（Ⅳ）NP-c RGD对SKOV3细胞裸鼠皮下瘤治疗后,显著抑制了肿瘤生长。组织病理和免疫组化分析结果表明,超声联合Pt（Ⅳ）NP-c RGD引起了线粒体介导的细胞凋亡。此外,Pt（Ⅳ）NP-c RGD具有良好的体内超声显像效果。结论本课题成功构建了具有长循环特性和肿瘤靶向特性的GSH敏感型和超声响应型的多功能纳米相变超声造影剂（Pt（Ⅳ）NP-c RGD）,用于卵巢癌的精准诊疗。超声联合Pt（Ⅳ）NP-c RGD具有良好的体内外超声显像效果,同时具有极好的体内外抗肿瘤效果,其抗肿瘤作用机制与活性氧水平升高引起线粒体介导的细胞凋亡相关。因此,本课题构建的纳米级相变超声造影剂可以为多功能超声造影剂的发展提供有价值的参考。