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研究背景:胰腺是由内分泌部和外分泌部组成的消化器官和内分泌器官。其中,胰腺腺泡细胞（PACs）是胰腺外分泌部的最主要细胞及功能单位,主要负责消化酶的合成、储存和分泌。胰腺炎是一种首先发生于PACs,并由PACs损伤驱动的炎症性疾病。因此,阐明PACs损伤的分子机制,对于胰腺炎的防治具有重要的科学意义。周期素依赖性激酶5调节亚单位相关蛋白3（CDK5RAP3）是一多功能分子,在DNA损伤反应、细胞周期的进展、蛋白翻译后修饰、细胞信号转导等不同的细胞生物学过程中发挥作用。此外,CDK5RAP3在胚胎发育、哺乳动物的肝细胞和肠上皮细胞功能维持以及肿瘤发生发展中具有重要作用。但CDK5RAP3与胰腺炎的关系未见国内外公开报道。有趣的是,本研究团队前期研究发现,条件性敲除PACs中CDK5RAP3可导致小鼠PACs大量萎缩,胰腺组织淀粉酶表达降低,提示CDK5RAP3在维持PACs的存活与功能中具有重要作用。本课题旨在继续探究CDK5RAP3在胰腺炎诱导PACs损伤中的作用及其潜在的分子机制。目的:基于内质网应激（ERS）通路探讨CDK5RAP3在雨蛙肽诱导的PACs损伤中的作用。方法:1.实验分组及处理:（1）小鼠急性（AP）和慢性（CP）胰腺炎模型:模型组（腹腔注射雨蛙肽）和对照组（腹腔注射等量PBS）;（2）雨蛙肽诱导AR42J损伤模型:不同浓度（0、100、400、800 n M组）雨蛙肽处理48 h和800 n M雨蛙肽处理不同时间（0、12、24、48 h组）;（3）外源性干预CDK5RAP3表达实验:Cer组（雨蛙肽处理）、si NC+Cer组（转染Negative control si RNA+雨蛙肽处理）或vector+Cer组（转染vector+雨蛙肽处理）、#1+Cer组（转染#1-CDK5RAP3si RNA+雨蛙肽处理）或over+Cer组（转染CDK5RAP3过表达质粒+雨蛙肽处理）;（4）淀粉酶诱导实验:未处理组（正常培养细胞）、雨蛙肽组（雨蛙肽处理）、地塞米松组（地塞米松处理）、雨蛙肽+地塞米松组（雨蛙肽联合地塞米松处理）;（5）ERS抑制剂4-PBA干预实验:si NC组（转染Negative control si RNA+雨蛙肽处理）、si RNA组（转染#1-CDK5RAP3 si RNA+雨蛙肽处理）、vehicle组（转染Negative control si RNA+PBS+雨蛙肽处理）、4-PBA组（转染Negative control si RNA+4-PBA+雨蛙肽处理）vehicle+si RNA组（转染#1-CDK5RAP3 si RNA+PBS+雨蛙肽处理）、4-PBA+si RNA（转染#1-CDK5RAP3 si RNA+4-PBA+雨蛙肽处理）。2.AP和CP的评估:构建雨蛙肽诱导的AP和CP模型,苏木素-伊红（H＆E）染色观察小鼠胰腺组织的病理形态;Masson染色评估CP模型小鼠胰腺组织的胶原纤维沉积程度。3.CDK5RAP3的蛋白表达评估:Western Blot或免疫组化方法检测组织或细胞中CDK5RAP3的蛋白表达水平。4.AR42J细胞损伤评估:（1）CCK-8实验检测细胞活力;（2）细胞毒实验检测细胞LDH漏出率;（3）Hoechst 33342/PI荧光双染法观察细胞凋亡;（4）Western Blot法检测凋亡相关蛋白:PARP、Bcl-XL、Bcl2/Bax、Cleaved-Caspase3、Bad;（5）Western Blot和AMS法检测细胞中淀粉酶的表达及含量。结果:1.雨蛙肽体内外诱导PACs损伤及下调CDK5RAP3的表达（1）与对照组比较,AP和CP模型组胰腺腺泡结构破坏,PACs损伤及炎症细胞浸润,且病理评分更高（均P＜0.001）,而且CP模型组胰腺组织中胶原纤维沉积更多（P＜0.01）,AP和CP模型组胰腺组织中CDK5RAP3的蛋白表达均更低（P＜0.001和P＜0.01）。（2）与0 n M雨蛙肽组比较,雨蛙肽（400、800 n M）显著抑制AR42J细胞活力（均P＜0.001）,增加AR42J细胞LDH漏出率（P＜0.05和P＜0.001）和细胞凋亡,上调促凋亡相关蛋白Bad、PARP、Cleaved-Caspase 3的蛋白表达（均P＜0.05）,而下调Bcl2/Bax、Bcl-XL及CDK5RAP3的蛋白表达（均P＜0.001）;与0 h雨蛙肽组比较,48 h雨蛙肽组AR42J细胞活力明显降低（P＜0.001）,LDH漏出率（P＜0.001）和细胞凋亡明显增加,Bad、PARP、Cleaved-Caspase 3的蛋白表达增加（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.05）,而Bcl2/Bax、Bcl-XL及CDK5RAP3的蛋白表达降低（P＜0.001、P＜0.01、P＜0.001）;与未处理组比较,雨蛙肽+地塞米松组的AR42J细胞淀粉酶表达及含量明显增加（均P＜0.001）。2.CDK5RAP3减轻雨蛙肽诱导的AR42J细胞损伤（1）与Cer组比较,#1+Cer组CDK5RAP3表达、AR42J细胞活力显著降低,LDH漏出率、淀粉酶的表达及含量升高（P＜0.01、P＜0.05、P＜0.001）,凋亡细胞增加,Bad、PARP、Cleaved-Caspase 3的蛋白表达增强（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01）,而Bcl2/Bax、Bcl-XL的蛋白表达降低（P＜0.001、P＜0.05）。（2）与Cer组比较,over+Cer组CDK5RAP3表达、AR42J细胞活力显著增加（P＜0.001、P＜0.01）,LDH漏出率、淀粉酶的表达及含量均下降（P＜0.001、P＜0.001、P＜0.05）,凋亡细胞减少,Bad、PARP、Cleaved-Caspase 3的蛋白表达降低（P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01）,而Bcl2/Bax、Bcl-XL的蛋白表达增强（均P＜0.05）。3.CDK5RAP3通过调控ERS减轻雨蛙肽诱导的AR42J细胞损伤（1）与0 n M雨蛙肽组比较,800 n M组雨蛙肽处理48 h显著增加AR42J细胞的ERS相关蛋白IRE1α、p-e IF2α、ATF6、CHOP、XBP1s的蛋白表达（均P＜0.01）,但GRP78/Bip的蛋白表达却降低（P＜0.01）;与0 h雨蛙肽组比较,800n M雨蛙肽12 h组IRE1α、p-e IF2α、ATF6、CHOP、XBP1s、GRP78/Bip的蛋白表达均增强（均P＜0.01）,而雨蛙肽处理24和48 h后IRE1α、ATF6、CHOP、XBP1s、GRP78/Bip的蛋白的表达均较12 h组降低（均P＜0.05）。（2）与Cer组比较,#1+Cer组ERS相关蛋白IRE1α、p-e IF2α、ATF6、CHOP、XBP1s、GRP78/Bip的蛋白表达明显增强（均P＜0.001）,而over+Cer组这些ERS相关蛋白的表达降低（均P＜0.05）。（3）与vehicle组比较,4-PBA不仅可减轻雨蛙肽诱导的AR42J细胞损伤及抑制ERS通路的活化,而且可部分逆转CDK5RAP3 si RNA导致的AR42J细胞损伤以及ERS通路的活化。结论:1.雨蛙肽在体内外均可诱导PACs损伤,并下调CDKRAP3蛋白表达水平。2.CDK5RAP3在雨蛙肽诱导的AR42J细胞损伤中具有保护作用。3.CDK5RAP3负向调控ERS通路影响雨蛙肽诱导的AR42J细胞损伤。