桃GRAS家族成员的鉴定及DELLA亚族的功能分析

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桃(Prunuspersica(L.)Batsch)是蔷薇科(Rosaceae)植物,是我国重要的果树树种。现有的桃主栽品种营养生长旺盛,导致修剪量大,增加了果园劳动量的投入。因此,合理调控桃树株高对优化果园生产效率显得尤为重要。GRAS家族基因是植物中一类重要的转录因子家族,其参与多种信号通路进而影响植物生长发育,其中的DELLA亚族通过参与赤霉素信号传导进而调控植物株高。本研究一方面利用生物信息学的方法,鉴定出桃GRAS转录因子家族的成员,并对鉴定出来的成员进行分类与保守基序等分析;另一方面对DELLA亚族三个成员(PpDELLA1、PpDELLA2和PpDELLA-like)分别进行克隆并对其中1个DELLA成员进行人工改造使其DELLA结构发生突变,针对包含/缺失DELLA结构的DELLA蛋白编码基因同时构建超表达载体,利用农杆菌介导法转化拟南芥后对表型进行鉴定。研究结果为进一步探索桃GRAS家族成员分子功能奠定基础,同时三个DELLA蛋白编码基因的功能确定为后续研究DELLA蛋白调控桃节间长度分子机制及通过基因工程手段创制桃(半)矮化新种质提供理论依据。主要结果如下:1、桃GRAS转录因子家族成员鉴定与分析利用Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk)网站中的GRAS结构域(PF03514)比对到下载的GDR数据库中,使用生物信息学工具筛选到48个桃GRAS转录因子家族成员,绘制染色体分布图并将所有成员按其在染色体位置上的顺序进行命名。利用生物信息学方法对48个桃GRAS家族成员进行基因物理位置、基因与蛋白结构、亚细胞定位预测、系统进化与保守基序分析,结果显示:48个桃GRAS转录因子在8条染色体上不均匀分布(2条分布不到染色体),其中在6号染色体上成员最多并成簇存在;所有基因CDS序列长度在1218~2550 bp之间,内含子数量小于1;48个桃GRAS蛋白分子量介于45828.06^-91964.82Da之间,除PpGRAS16和PpGRAS37之外,其余均为酸性氨基酸;对不稳定指数的分析发现,除PpGRAS2外均为亲水蛋白;所有桃GRAS蛋白预测均定位于细胞核中,二级结构均以无规则卷曲和α螺旋为主;与拟南芥GRAS蛋白一起进行系统发育以及蛋白保守结构分析,将桃的48个GRAS成员分为11类,且与拟南芥GRAS蛋白具有较高的同源性。2、桃DELLA蛋白编码基因克隆与功能验证(1)桃DELLA蛋白编码基因克隆、命名及生物信息学分析。使用同源克隆法成功克隆了桃GRAS基因中DELLA亚族三个成员PpGRAS12、PpGRAS5、PpGRAS42,分别命名为PpDELLA1、PpDELLA2和PpDELLA-like,三个基因全长分别为1782 bp、1902 bp和1614 bp,分别编码593、633和537个氨基酸。三个PpDELLA蛋白与拟南芥DELLA蛋白同源性较高,其中PpDELLA1和PpDELLA2含有N端的DELLA结构域和TVHYNP结构域,PpDELLA-like没有完整的DELLA结构域与TVHYNP结构域。此外,将GDR数据库中与PpDELLA2处于同一染色体物理位置的编号为Prupe.1G329600.1基因(不含完整的DELLA与TVHYNP结构域)命名为Ppdella2。使用重叠延伸PCR对PpDELLA1进行基因改造,使其编码蛋白中的‘DELLA’结构突变为‘DELLS’,并命名为Ppdella1。(2)三个桃DELLA蛋白编码基因组织器官特异性表达分析。利用qPCR检测分析PpDELLA1、PpDELLA2和PpDELLA-like基因在半矮生桃‘中油桃14号’不同组织(器官)的表达量,结果显示:三个基因在‘中油桃14号’茎尖、花、胚、嫩叶、成熟叶和果实中均有表达,其中PpDELLA1在成熟叶中表达最高,PpDELLA2在胚中表达量最高,PpDELLA-like在嫩叶中表达量最高。PpDELLA-like在所有部位的表达量均高于PpDELLA1及 PpDELLA2。(3)桃DELLA蛋白编码基因功能验证。分别对PpDELLA1、Ppdella1、PpDELLA2、Ppdella2和PpDELLA-like构建超表达载体,并利用农杆菌介导的转化法转化野生型拟南芥,对转基因植株进行形态观察。结果显示:转35S::PpDELLAd1与35S::Ppdella1所有株系T0代植株株高均低于WT;转35S::PpDELLA1与35S::Ppdella1的Ti代植株与WT相比表现出不同程度的矮化与平均节间长度变短,且株高越低,PpDELLA1的表达量越高,同时发现转35S::Ppdella1株系株高均低于转35S::PpDELLA1株系。转35S::Ppdella2所有株系To代株高出现矮化与半矮化两种表型,且与WT相比,两种表型的平均节间长度均变短;转35S::PpDELLA2的To代株系出现株高半矮化与株高正常两种表型,且转35S::Ppdella2的植株比转35S::PpDELLA2植株矮化及平均节间长度变短的表型更明显;qPCR结果发现转35S::Ppdella2与35S::PpDELLA2的T0代植株越矮,外源基因(PpDELLA2)的表达量越高。此外,转35S::Ppdella2拟南芥的T1代植株也表现出不同程度的矮化。
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