铁皮石斛内生放线菌次级代谢产物生物活性研究

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植物内生菌是丰富的微生物资源,放线菌是活性天然产物的重要产生菌,因此,植物内放线菌作为微生物资源开发具有很大潜能。铁皮石斛是一种珍贵的中药材,具有重要的生理活性,其内生放线菌与宿主之间可能会发生水平基因转移或基因重组,从而使内生放线菌产生与宿主相同或相似的生理活性物质。因此,本研究以铁皮石斛植物内生放线菌为研究对象,对其次级代谢产物生物活性进行了研究,主要研究内容及结果如下:本研究以河北省微生物多样性研究与应用实验室分离、保藏的13株铁皮石斛内生放线菌作为研究对象,首先对13株供试菌株进行系统发育分析,研究结果表明,13株供试菌株中,链霉菌属(Streptomyces)有6株,假诺卡氏属(Pseudonocardia)4株,分枝杆菌属(Mycobacterium)1株,分枝酸杆菌属(Mycolicibacter)1株,拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)1株,表明铁皮石斛内生放线菌物种多样性较丰富。对供试菌株的次级代谢产物进行α-葡萄糖苷酶、乳腺癌MCF-7细胞系、病原指示菌抑制活性测定实验,结果表明,有6株供试菌株表现出对α-葡萄糖苷酶50%以上的抑制活性,2株菌株对α-葡萄糖苷酶抑制率在70%以上,7株菌株表现出对乳腺癌MCF-7细胞40%以上的抑制率,有12株供试菌株至少抑制一种病原指示菌,其中,2055473、205518-1、205524、205527表现出较强广谱抑菌活性,总的来看,供试菌株对病原细菌的抑制效果明显高于病原真菌。综合三种活性测定结果来看,有10株内生放线菌同时具有两种及两种以上活性,其中链霉菌属的活性优于其它属的供试菌株,其活性物质值得深入研究。综合活性结果和活性菌株次级代谢产物初步分析,选定了一株活性较好且次级代谢产物丰富的链霉属菌株205527作为出发菌株对其次级代谢产物进行研究,通过HPLC检测化合物峰的紫外特征吸收,确定利用F发酵培养基对其进行批量发酵,利用发酵罐发酵,共得到发酵产物145 L,发酵液经乙酸乙酯萃取、旋蒸浓缩,得到粗提物浸膏30.63g。利用薄层层析、凝胶柱层析、Biotage快速制备色谱、高效液相色谱、制备液相色谱等方法对浸膏进行分离、纯化,分纯的化合物用1H-NMR、13C-NMR、和LC-MS进行结构鉴定,最终得到4个活性化合物,化合物分别为4-N-羟基-1-N-甲基-3-E-苯亚甲基-6-E-亚异丁基-2,5-哌嗪二酮、1H-吡咯-2-甲酰胺、(3Z,6E)-1-N-甲基-3-苯亚甲基-6-(2S-甲基-3-羟丙基)-哌嗪-2,5-二酮和水杨酰胺。
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