论文部分内容阅读
目的:骨代谢异常对患者的生活质量及疾病控制有一定影响。骨钙素(OCN)是成骨细胞活性及分化的指标之一,本文旨在对MC3T3-E1 Subclone 14细胞辐射与RNA干扰方法敲减ppGalNAc-T1处理后对OCN表达的影响进行研究,以判定多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶1(ppGalNAc-T1)与OCN表达变化相关性,从而对ppGalNAc-T1基因在成骨细胞活性及分化机制中的作用及辐射的影响有一初步了解。方法:1.对MC3T3-E1 Subclone 14细胞进行0Gy、0.5Gy、1.0Gy、2.0Gy剂量辐射24h后进行MTT测吸光值,观察细胞在5天内的增殖情况差异。2.对MC3T3-E1 Subclone 14细胞进行0Gy、0.5Gy、1.0Gy、2.0Gy剂量辐射24h后,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡差异。3.对MC3T3-E1 Subclone 14细胞进行0Gy、0.5Gy、1.0Gy、2.0Gy剂量辐射24h后换液培养至14d,RT-PCR检测4d、7d、10d、14d时ppGalNAc-T1和OCN的表达差异。4.设计四条可能的ppGalNAc-T1小干扰RNA(siRNA),分别将这四段siRNA插入到RNA干扰载体pGPU6/GFP/Neo中构建成四条干扰载体pGPU6/GFP/Neo-si ppGalNAc-T1-1,2,3,4。5.通过脂质体介导将四条干扰表达载体按最优转染体系转染MC3T3-E1 Subclone 14细胞,48小时后,RT-PCR方法检测ppGalNAc-T1基因在转录水平的差异,筛选出对ppGalNAc-T1有最佳抑制效果的干扰表达载体。6.将筛选出的最佳干扰表达载体转染MC3T3-E1 Subclone 14细胞,48小时后,通过RT-PCR方法检测ppGalNAc-T1在mRNA的改变,并通过RT-PCR、Western-Blot方法分别检测OCN mRNA和蛋白表达量的差异。结果:1. 0.5Gy、2.0Gy剂量辐射与空白对照组相比,不能明显影响MC3T3-E1 Subclone 14细胞增殖能力(P>0.05),而1.0Gy剂量辐射显著能增强细胞增殖能力(P﹤0.05)。2. 0.5Gy、2.0Gy剂量辐射与空白对照组相比,对MC3T3-E1 Subclone 14凋亡没有明显影响(P>0.05),而1.0Gy剂量辐射对MC3T3细胞凋亡有显著的抑制作用(P﹤0.05)。3. 0.5Gy,1.0Gy及2.0Gy剂量辐射与空白对照组相比,均能上调OCN和ppGalNAc-T1 mRNA的表达趋势,其中1.0Gy组的表达显著高于空白对照组(P﹤0.05)。4.成功构建四条ppGalNAc-T1干扰表达载体。5.成功筛选出一条对ppGalNAc-T1基因抑制效率较高的siRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo-sippGalNAc-T1-919。6. RT-PCR及WesternBlot结果显示:转染了有效干扰载体pGPU6/GFP/Neo-si ppGalNAc-T1-919的细胞,ppGalNAc-T1基因表达明显下调,同时OCN mRNA和蛋白表达量明显下调。结论:1.辐射剂量1.0Gy可显著促进MC3T3-E1 Subclone 14细胞增殖,抑制细胞凋亡,上调OCN和ppGalNAc-T1 mRNA的表达。2.利用SiRNA干扰技术,构建ppGalNAc-T1干扰表达载体,并成功筛选出一条有效的ppGalNAc-T1基因的siRNA载体。通过检测转染后mRNA和蛋白水平表达量检测,结果显示:当有效阻断ppGalNAc-T1基因表达,OCN基因的表达也显著性受到抑制。为研究ppGalNAc-T1在成骨细胞分化与增殖过程中的作用提供了实验基础和理论支持,并为研究RNAi在临床上的应用提供了技术支持。