家蚕微孢子虫(Nesoma bombycis)是一种严格的细胞内寄生虫,体外以休眠孢子存在,可通过弹出极丝和细胞吞噬侵入宿主细胞。家蚕微孢子虫宿主范围较广,除家蚕外,柞蚕、果蝇、菜青虫和草地滩夜蛾等多种昆虫都能感染。在家蚕微孢子虫基因组信息分析中,发现一群ricin B-like(RBL)基因存在于家蚕微孢子虫基因组中,与此同时,在另外几种微孢子虫基因组中也发现相应的RBL基因。RBL是一大类与蓖麻毒素ricin蛋白B亚基具有类似结构域的蛋白统称。蓖麻毒素蛋白是一种异源二聚体毒素蛋白,具有A、B两个亚基,分别为RTA和RTB,B亚基能与细胞表面糖基受体结合从而介导和保护A亚基进入细胞内起作用。为阐明家蚕微孢子虫中这些RBL蛋白的功能以及其在家蚕微孢子虫整个生活史中所起作用,我们对家蚕微孢子虫中RBL基因进行了分析鉴定,并克隆表达了其中3个RBL基因,对其功能进行了初步探索研究。其结果如下:　　 1.家蚕微孢子虫(N.bombycis)RBL基因的鉴定及蛋白结构分析　　 采用蛋白结构分类(SCOP)在线软件Superfamily1.75分析和SMART在线预测,在家蚕微孢子虫基因组中共鉴定出了21个RBL基因,主要以串联形式分布在基因组数据的第6号Scaffold和第463号Scaffold上,其蛋白归属ricin B-like lectin超家族,由1个蛋白功能域构成。以家蚕微孢子虫RBL序列为基础进行BLSATp分析,结果在兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)、肠道微孢子虫(Encephalitozoon intestinalis)和蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)各自基因组中分别鉴定出4、2、8个RBL基因,都是以串联形式分布在基因组中。采用RBL蛋白功能域序列进行的多重序列比对分析表明,21个家蚕微孢子虫RBL基因中,有16个基因的蛋白功能域由2个QxW重复基序形成的α、β子域构成,另外5个基因的蛋白功能域仅有1个QxW重复基序,而典型的RBL,功能域则由3个QxW重复基序形成的α、β和γ子域构成,家蚕微孢子虫RBL蛋白这种功能域结构的差异可能会导致其蛋白功能的差异。以RBL蛋白功能域构建的系统进化树显示,所有微孢子虫RBL基因聚在一起,家蚕微孢子虫RBL基因又单独聚为一枝,家蚕微孢子虫RBL基因的串联重复是发生在微孢子虫分化之后,其后又发生了一次片段重复事件,导致基因组中RBL基因数量大增。蛋白结构预测分析表明,21个家蚕微孢子虫RBL基因中有9个具有典型的分泌信号,2个具有跨膜域,绝大部分蛋白具有二硫键和糖基化位点。　　 2.家蚕微孢子虫RBL基因的原核表达及多克隆抗体制备　　 选择家蚕微孢子虫基因组数据中第463号Scaffold上串联的RBL463-1、RBL463-2、RBL463-4三个RBL基因进行原核表达和抗体制备。以基因组DNA为模板,对RBL463-1、RBL463-2、RBL463-4进行PCR扩增,成功构建了原核表达载体pGEX463-1、pGEX463-2和pGEX463-4,然后转入Ecoli BL21中进行诱导表达,所获融合表达蛋白全为包涵体形式,其分子量大小分别在55KD、48kD和48kD左右,与其分子量预测大小相近。融合蛋白经SDS-PAGE电泳后,切取蛋白条带研磨后与弗氏佐剂乳化制备抗原免疫小鼠和家兔,3免后第7天无菌采血分离血清,琼扩法测定这3个融合蛋白制备的多克隆抗体效价都在1:200左右,满足进一步研究需要。　　 3.RBL基因在家蚕微孢子虫中的转录及表达　　 为确定RBL463-1,RBL463-2,RBL463-4基因在家蚕微孢子虫中的转录和表达活性,取添食感染家蚕微孢子虫的家蚕中肠组织,从第1d连续采集到第10d,分别提取总RNA,采用RT-PCR方法,对RBL463-1,RBL463-2和RBL463-4基因进行扩增,仅RBL463-1基因在家蚕微孢子虫感染全期都有转录,而RBL463-2和RBL463-4基因直到感染的第3天才检测到明显的转录,在第6天又都未检测到转录,该结果表明,这3个RBL基因在家蚕微孢子虫中的表达时期存在明显差异,在基因组位置上虽串联在一起,但非同步转录。通过对新鲜孢子和4℃保存了3年的孢子总蛋白进行免疫印迹检测发现,仅在新鲜孢子中检测到RBL463-1一种蛋白,而在陈年孢子中3个蛋白都没能检测到;在以成熟孢子和孢子感染细胞为材料进行IFA检测时发现,仅在分裂期的孢子中检测到了3个蛋白的表达,在成熟孢子中没有检测到荧光信号的原因可能在于成熟孢子较厚的孢壁阻止了抗体进入到孢质中与抗原反应或蛋白表达量过少。综合可以得出,这3个RBL基因都具有活性,其中RBL463-1在家蚕微孢子虫整个生活史中都有表达,而RBL463-2和RBL463-4仅在家蚕微孢子虫繁殖的某个阶段才有转录表达。　　 4.家蚕微孢子虫RBL蛋白性质和功能研究　　 采用原核和真核表达系统对RBL463-1、RBL463-2和RBL463-4蛋白进行可溶性表达,对其蛋白性质和功能的研究,为RBL蛋白在家蚕微孢子虫中所起作用提供依据。　　 根据RBL463-1、RBL463-2和RBL463-4蛋白质结构分析,分别设计了扩增全长和去N端疏水部分基因引物,双酶切位点综合考虑了原核和真核表达载体多克隆位点和基因本身酶切位点信息。提取感染家蚕微孢子虫第8天的家蚕中肠组织总RNA,通过RT-PCR.方法,分别扩增出全基因RBL463-1、RBL463-2、RBL463-4和去N端疏水部分基因dRBL463-1、dRBL463-2、dRBL463-4,克隆到原核表达载体pET30α和真核表达载体pPICZα-A上,转入E.coli BL21(DE3)和毕赤酵母X33中,获重组表达茵分别为BL21/pET30-RBL463-1、BL21/pET30-RBL463-2、BL21/pET30-RBL463-4、BL21/pET30-dRBL463-1、BL21/pET30-dRBL463-2、BL21/pET30-dRBL463-4以及X33/pPICZα-RBL463-1、X33/pPICZα-RBL463-2、X33/pPICZα-RBL463-4、X33/pPICZα-dRBL463-1、X33/pPICZα-dRBL463-2、X33/pPICZα-dRBL463-4。　　 以pET30α为载体的原核表达中,仅去N端疏水部分基因dRBL463-1、dRBL463-2、dRBL463-4获少量可溶表达,可溶蛋白经His亲和层析,超滤除盐浓缩后,分别过乳糖-琼脂糖柱,dRBL463-1和dRBL463-4融合蛋白具有与乳糖结合的能力;分别以可溶表达纯化蛋白注射家蚕和添加sf9细胞,家蚕正常发育并结茧,sf9细胞没有明显病变;以DTSSP交联剂对这3个融合蛋白进行交联处理,结果表明3个蛋白间具有相互作用。在蛋白分离纯化和功能测定的过程中发现,该3个蛋白可溶表达量低并且表达不稳定,易于降解,dRBL463-1部分降解片段具有乳糖结合活性。　　 在毕赤酵母表达系统中,仅X33/pPICZα-dRBL463-2和X33/pPICZα-RBL463-4有非常低量的融合蛋白表达,采用Western blot方法才能检测得到,所表达的融合蛋白具有不均一性。随着诱导时间的增加,蛋白开始降解,诱导时间越长蛋白降解越严重,当诱导超过120h后基本上检测不到所表达蛋白,以24-48h诱导表达为佳。融合表达蛋白直接经His亲和层析,超滤除盐,过乳糖.琼脂糖柱,没有检测到蛋白与乳糖结合,其原因可能是由于在纯化处理过程中导致的蛋白降解和失活致使其乳糖结合功能的丧失。RBL463-1、RBL463-2、RBL463-4基因在毕赤酵母中不表达或表达量低,表明其融合表达蛋白可能会对酵母细胞的生长代谢产生不利影响。　　 为了解RBL463-1、RBL463-2和RBL463-4蛋白在细胞中的作用位置,分别把这3个基因克隆到酿酒酵母表达载体pUG35上,获重组表达载体分别为pUG35-RBL463-1、pUG35-RBL463-2和pUG35-RBL463-4,电击转化酿酒酵母CEN.PK2,获重组表达菌分别为CEN/pUG35-RBL463-1、CEN/pUG35-RBL463-2和CEN/pUG35-RBL463-4,经无甲硫氨酸培养基诱导表达,荧光显微镜观测发现,RBL463-1融合蛋白能够结合分布于酵母线粒体和内质网上,RBL463-2融合表达蛋白散在分布于细胞质中,RBL463-4融合表达蛋白结合分布于内质网上。这3个蛋白在酵母细胞中的分布位置差异表明了在家蚕微孢子虫中不同ricin B-like蛋白起作用的位置存在差异。