第一内含子调控巢蛋白在C2C12成肌干细胞分化过程中的表达背景介绍一骨骼肌发生骨骼肌的发生包括肌肉前体细胞的生成,以及前体细胞的分化,成熟。肌肉前体细胞存在于体节中;体节为轴旁中胚层来源;正常情况下,新生体节的分化受来自神经管和脊索信号的调控[1,2,3,4,5]。体节腹侧（ventral）形成生骨节（sceterotome）,分化成椎骨和肋骨;体节背部生成生皮肌节[6,7],分化成肌刀;另外,生皮肌节的外侧缘的肌肉前体细胞开始向肢芽迁移。生皮肌节的细胞还能生成皮肤[6,7]。肌前体细胞迁移至肢芽目的位置后,开始表达MyoD和myf5等肌生成因子,退出细胞周期,融合成多核的肌管,最终生成成熟的肌纤微[8]。在体节的发育过程中,位于生皮肌节中部的细胞直接迁移入肌刀中[26,28],成为成体肌肉干细胞,即卫星细胞的来源;在出生后肌肉的继续发育,以及肌肉损伤后的修复中,卫星细胞发挥了重要的作用。在我们的试验中,所使用的细胞模型是C2C12成肌干细胞,来源于卫星细胞[10,11,12]。二中等纤维蛋白中等纤维蛋白是细胞骨架的一种组成成分,与微管,微丝一起,形成了细胞质中的纤维网状结构[9],在细胞分裂,分化过程中交替表达和重新组装[16]。广泛表达的中等纤维蛋白为许多信号分子,和调控因子发挥作用提供了作用平台[14]。位于中间的α-螺旋棒状区是中等纤维蛋白（intermediatefilament）的特征性结构;按照蛋白质两端N-端,C-端序列的不同,可以将中等纤维蛋白分为六类,巢蛋白属于Ⅵ类中等纤维蛋白。位于生皮肌节的肌肉前体细胞能表达巢蛋白;并且巢蛋白在大鼠发育中的大腿肌中也表达,但是出生后4天,巢蛋白的表达消失[15]。原位杂交显示,在发育小鼠肢芽（limb bud）的肌肉生成过程中,巢蛋白表达是上调,而在软骨生成过程中是降低的[18]。在骨骼肌的发育过程中,巢蛋白的表达是动态变化的。三肌肉生成因子肌肉生成因子属于碱性-螺旋-环-螺旋（basic Helix-Loop-Helix）家族转录因子。这类转录因子的蛋白质二级结构中都含有一个60氨基酸左右的碱性-螺旋-环-螺旋（basic Helix-Loop-Helix）特征性结构域。其中螺旋-环-螺旋区域主要参与形成二聚体,而碱性氨基酸区域则负责与DNA结合。肌肉生成因子包括MyoD,myf5,myogenin和MRF4,它们在肌细胞命运决定,和分化过程中都发挥了重要的作用[19]。MRF是组织特异性的Ⅱ类bHLH转录因子,在特定的组织中表达;Ⅱ类bHLH转录因子能够形成同源二聚体;或与广泛表达的Ⅰ类bHLH转录因子形成异源二聚体。bHLH同源或异源二聚体能与保守的E-box序列（CANNTG）结合,调控基因的表达[23]。四巢蛋白基因（nestin gene）我们实验室一直在进行巢蛋白（nestin）方面的研究。我们通过筛选小鼠细菌人工染色体（BAC）基因组文库,得到小鼠巢蛋白基因组序列全长23.3 kb,该基因由4个外显子和3个内含子组成[24,25]。转基因小鼠技术证明巢蛋白基因的第二内含子,第一内含子分别指导LacZ报告基因在发育中的中枢神经系统中表达,以及LacZ报告基因在肌刀和神经前体细胞中同时表达[39];并且已经证明第二内含子是一个神经特异性增强子[39]。但是对于巢蛋白基因的第一内含子的作用机制,尤其是第一内含子如何指导LacZ在肌肉前体细胞中表达的机制,研究得极少。研究思路1,体外试验。通过构建包含第一内含子系列缺失的荧光素酶报告基因质粒,转染C2C12成肌干细胞,诱导C2C12成肌干细胞分化,检测荧光素酶活性变化,以确定具有增强子活性的序列;然后构建顺势作用元件突变的质粒,检测荧光素酶活性变化,以确定参与增强子活性调控的顺势作用元件;通过过表达肌生成因子,检测参与调控的有关的转录因子。确定了参与调控的顺势作用元件和相关的转录因子后,我们下一步就运用染色质免疫共沉淀技术,或者凝胶阻滞实验来寻找二者结合的直接证据。2,体内试验,通过构建转基因鼠,以及鸡胚电转的方法,进一步验证我们所找到的增强子在体内的活性。研究结论我们发现巢蛋白的第一内含子中存在一个成肌干细胞特异性增强子,它能够调控巢蛋白在小鼠C2C12成肌干细胞分化过程中的表达;位于第一内含子291-661位碱基的DNA序列,是增强子的核心序列;分别位于476-472位,539-555位碱基的E-box对于核心序列的活性是必须的;肌生成因子MyoD蛋白参与了肌肉特异性增强子活性的调控。我们进一步设计试验证实增强子在体内的活性。中等纤维蛋白与微管,微丝一起组成了纤维网状的细胞骨架[9],在细胞分裂,分化过程中交替表达和重新组装[16]。中等纤维蛋白的特征性结构是具有α-螺旋的棒状区域,按照N端和C端序列的不同,中等纤维蛋白分为六类;而巢蛋白（nestin）就属于第六类中等纤维蛋白,表达于中枢神经系统的神经前体细胞,和正在发育的骨骼肌中[13,16]。巢蛋白被做广泛的做为一类神经干细胞的标记蛋白。已有研究表明,巢蛋白的第二内含子序列中存在一个神经特异性增强子,它调控了巢蛋白在神经前体细胞中的表达;研究同时指出第一内含子能指导LacZ报告基因同时在肌刀中表达[39];但是,对于第一内含子指导巢蛋白表达的调控机制,尤其是第一内含子如何指导巢蛋白在肌肉前体细胞中表达的,研究极少。通过构建第一内含子序列缺失的质粒,检测荧光素酶报告基因活性变化,我们发现巢蛋白的第一内含子中存在一个成肌干细胞特异性增强子,它能够调控巢蛋白在小鼠C2C12成肌干细胞分化过程中的表达;位于第一内含子291-661位碱基的DNA序列,是增强子的核心序列;分别位于476-492位,539-555位碱基的E-box对于核心序列的活性是必须的;肌生成因子MyoD蛋白参与了肌肉特异性增强子活性的调控。我们进一步设计试验证实增强子在体内的活性。