肿瘤时刻威胁着人类的生命,寻找治愈肿瘤的方法一直是人类健康科学最重要的研究内容。肿瘤抑癌基因p53在肿瘤的发生、发展和调控中起着异常重要的作用,在许多重要的细胞信号通路中,p53可以激活抑癌基因的表达从而抑制肿瘤的发生,而p53基因的突变、缺失或减少常常导致细胞内信号通路发生紊乱,从而引发细胞生长失控并发生癌变。由于p53基因在肿瘤中具有相当高的突变频率,因此针对p53的靶向研究是治疗肿瘤的重要研究方向。COP1和DET1蛋白于三十多年前首次被人类发现,作为最早的光形态发生抑制因子之一,DET1和COP1复合物是最初在植物中被深入研究的光信号通路关键分子。而在哺乳动物细胞中,人们意外发现COP1可以作为p53泛素化的一种E3泛素连接酶,从而抑制p53的转录激活活性及依赖p53的细胞凋亡,这种COP1介导的p53降解途径主要是维持DNA损伤被修复后p53的稳定和再次激活。同时COP1能够通过与DET1相互作用形成复合物进而催化原癌基因转录因子c-Jun的泛素化降解,此时由于COP1和DET1复合物的形成,COP1并不会表现出E3泛素连接酶的功能,通过复合物的作用一定程度上拮抗c-Jun的致癌活性发挥作用。在本次研究中,我们主要在体外对p53、COP1和DET1蛋白之间可能存在的相互作用进行探究。在本研究中,我们采用了基因工程与蛋白质工程等技术手段,通过细胞培养大量表达人源p53、COP1和DET1蛋白,并使用精细色谱分离纯化得到三种目标蛋白,然后对三者之间的相互作用进行了进一步的研究。首先我们利用原核细胞表达载体pGEX-6P-1,成功构建了人源p53全长蛋白载体质粒,由于p53在细胞核中通常以四聚体形式存在,经分子筛纯化时非常容易出现高聚,所以我们尝试了多种分片段表达方法,针对p53全长、1-104、349-398、98-398等片段,在大肠杆菌BL21中表达,经GST柱及分子筛层析分离纯化相关蛋白片段。在人源COP1、DET1蛋白全长的表达与纯化实验中,我们对COP1和DET1蛋白的表达载体采用真核细胞表达载体,成功构建了COP1和DET1的pcDNA3.1(+)重组表达质粒,利用大肠杆菌感受态细胞DH5α克隆重组质粒,克隆质粒在含有Amp的LB琼脂培养基上进行抗性初步筛选,再转染到HEK293F细胞株中进行表达。通过对转染细胞的培养、传代、收取及后续的精细纯化,我们初步得到了COP1和DET1蛋白,但表达量非常低。在此基础上,我们还通过体外pull-down实验对COP1、DET1和p53蛋白的相互作用进行了进一步的研究。通过本论文的研究,我们成功表达与纯化了人源p53片段蛋白,成功构建了能稳定表达人源COP1、DET1蛋白的HEK293F细胞株,为进一步研究人源COP1、DET1与p53复合物及相互作用打下了良好的基础。