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蛋白和核酸即是生物体的组成部分,也是生理功能的重要执行者,而其功能的执行往往与其结构密切相关,因此通过解析蛋白质的结构将有助于增强我们对于其功能的认识,理解其参与生命过程的意义。轮状病毒是引起婴幼儿腹泻的病毒之一,本实验室之前的研究结果显示病毒VP6蛋白与Ferritin蛋白融合成的蛋白纳米疫苗VP6-Ferritin,灌胃小鼠后可产生较高的Ig A和Ig G抗体水平,攻毒试验显示蛋白纳米疫苗对试验小鼠具有显著的保护力。本研究拟解析蛋白纳米疫苗VP6-Ferritin结构,试验取得如下研究,现结果如下:1.应用基因定向克隆技术成功构建了VP6-Ferritin的原核表达载体p ET 28a-Hrv-VP6-Ferritin,对该载体进行原核表达条件优化显示在37℃条件下,0.05mmol/L的IPTG诱导6 h左右达到最大值,使用SDS-PAGE电泳在60 k Da-70 k Da之间有一条明显的特异性蛋白条带与预期符合。在包涵体组分和总蛋白组分检测到VP6-Ferritin蛋白的条带,说明VP6-Ferritin蛋白在细菌中主要以包涵体的形式表达。2.对VP6-Ferritin在变性条件下纯化,当洗脱缓冲液的比例提高至30%时,获得了大量高纯度的VP6-Ferritin蛋白。通过梯度柱上复性对VP6-Ferritin进行重折叠,使用Superdex 200 pg对蛋白进行均一性检测,成功获得了VP6-Ferritin活性蛋白。透射电子显微镜观察复性后的蛋白质样品,发现对照组重组蛋白Ferritin在体外自组装为均匀的球状中空纳米颗粒,且纳米颗粒外表光滑,而VP6-Ferritin蛋白则呈现为球状实心纳米颗粒,且纳米颗粒外表粗糙,二者粒径相似,约为12-20 nm。应用Expasy对VP6-Ferritin的单体分子量进行预测,预测分子量为64.225 k Da,加上位于VP6-Ferritin N端的6 His标签和HRV-3c元件的2588.65 Da,所预测的理论分子量为66.81 k Da,而经HPLC-MS鉴定得VP6-Ferritin的精确单体蛋白分子量为66.911 k Da,而VP6-Ferritin的分子筛显示VP6-Ferritin复性后是一个高分子量多聚体蛋白。应用原子力显微镜和冷冻电镜下进一步对蛋白的形态与粒径进行了观察,显示相对于对照蛋白Ferritin,VP6-Ferritin失去了Ferritin之前棱角分明的结构,但依旧显示出是一个20 nm左右球形纳米颗粒结构;动态光散射显示蛋白会随着p H或解聚或自组装,蛋白在生理条件下粒径表现为24 nm,虽然比Ferritin粒径更大,但VP6-Ferritin同样显出了较好自组装能力。3.对蛋白进行了结晶,使用超滤浓缩管对VP6-Ferritin蛋白进行浓缩,将其浓缩至最大浓度2 mg/m L,滴加到结晶母液之上,在晶体培养的第12天时,在PEG结晶条件下初步观察到一个规整的晶体结构。结论:本研究成功表达了蛋白纳米疫苗VP6-Ferriitn,发现其为球形纳米颗粒,拥有着很好的自组装能力,可以在特定条件下解聚和自组装。本研究工作为研究蛋白纳米疫苗的作用机制奠定了基础。