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花青素的糖基化修饰增加了花青素的稳定性,对研究花青苷的组分和含量具有重要意义。植物花青素糖基修化饰以葡萄糖最为普遍,而苹果中主要积累矢车菊素-3-半乳糖苷,鲜有发现主要积累矢车菊素-3-葡萄糖苷的苹果材料。本试验以‘平邑甜茶’愈伤组织和苹果不同组织为试材,通过转录组测序分析及苹果不同组织相关基因表达分析,筛选出矢车菊素-3-葡萄糖苷转移酶候选基因,并将筛得基因在苹果愈伤组织中通过q-PCR进行验证。主要研究结果如下:
1.对不同组织材料中矢车菊素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-半乳糖苷含量测定发现,光培养‘平邑甜茶’愈伤组织中矢车菊素-3-葡萄糖苷含量显著高于矢车菊素-3-半乳糖苷含量;‘富士’、‘嘎啦’、‘乔纳金’、‘金冠’叶片愈伤组织和‘斗南’、‘富士’果皮中矢车菊素-3-半乳糖苷含量显著高于矢车菊素-3-葡萄糖苷含量。表明了‘平邑甜茶’愈伤组织可作为研究矢车菊素-3-葡萄糖苷转移酶的特异性材料。
2.本研究分别以暗培养18d、暗培养15d+光培养3d和暗培养15d+光培养6d的‘平邑甜茶’愈伤组织为试材,进行转录组测序分析。对转录组中差异基因GO功能富集分析发现,注释到生物过程的有光合作用;注释到细胞组分的有类囊体、光合膜、光系统、细胞壁和氧化还原酶复合物;注释到分子功能的有转录因子活性、水解酶活性、跨膜运输蛋白和抗氧化活性。对代谢通路分析发现,参与花青苷合成运输的有类黄酮合成途径、半乳糖代谢途径和谷胱甘肽代谢途径。对类黄酮合成途径分析发现,参与花青苷合成的结构基因PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、DFR和ANS相对于在暗培养‘平邑甜茶’愈伤组织在光下培养‘平邑甜茶’愈伤组织中都上调表达。
3.根据不同培养条件下‘平邑甜茶’愈伤组织基因的表达量差异和功能描述,筛选出24个可能的糖基转移酶基因。通过序列比对从中筛选出12个蛋白功能与糖基转移酶功能较近的基因。将这12个基因的氨基酸序列与桃中PpUGT78B的PSPG保守结构域进行氨基酸序列比对。发现有9个基因含有PSPG保守结构域,表明具有糖基转移酶活性,并且第44位氨基酸残基都是能够识别葡萄糖的谷氨酰胺Q(Gln),其中UG TA1-1比对的结果最高达到91%。
4.通过q-PCR测定12个基因在‘平邑甜茶’愈伤组织和苹果果皮的相对表达量,筛选出光培养‘平邑甜茶’愈伤组织的相对表达量显著高于苹果果皮的3个基因,分别为UGTA1-1、UGTA1-2和GlcAT14C。以候选基因在光培养‘平邑甜茶’愈伤组织中的相对表达量显著高于苹果愈伤组织为验证标准,发现只有GlcA T14C和UGTA1-1两个基因符合标准,但基因GlcAT14C中不含有PSPG保守结构域。初步认为UGTA1-1是矢车菊素-3-葡萄糖基转移酶的候选基因。
1.对不同组织材料中矢车菊素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-半乳糖苷含量测定发现,光培养‘平邑甜茶’愈伤组织中矢车菊素-3-葡萄糖苷含量显著高于矢车菊素-3-半乳糖苷含量;‘富士’、‘嘎啦’、‘乔纳金’、‘金冠’叶片愈伤组织和‘斗南’、‘富士’果皮中矢车菊素-3-半乳糖苷含量显著高于矢车菊素-3-葡萄糖苷含量。表明了‘平邑甜茶’愈伤组织可作为研究矢车菊素-3-葡萄糖苷转移酶的特异性材料。
2.本研究分别以暗培养18d、暗培养15d+光培养3d和暗培养15d+光培养6d的‘平邑甜茶’愈伤组织为试材,进行转录组测序分析。对转录组中差异基因GO功能富集分析发现,注释到生物过程的有光合作用;注释到细胞组分的有类囊体、光合膜、光系统、细胞壁和氧化还原酶复合物;注释到分子功能的有转录因子活性、水解酶活性、跨膜运输蛋白和抗氧化活性。对代谢通路分析发现,参与花青苷合成运输的有类黄酮合成途径、半乳糖代谢途径和谷胱甘肽代谢途径。对类黄酮合成途径分析发现,参与花青苷合成的结构基因PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、DFR和ANS相对于在暗培养‘平邑甜茶’愈伤组织在光下培养‘平邑甜茶’愈伤组织中都上调表达。
3.根据不同培养条件下‘平邑甜茶’愈伤组织基因的表达量差异和功能描述,筛选出24个可能的糖基转移酶基因。通过序列比对从中筛选出12个蛋白功能与糖基转移酶功能较近的基因。将这12个基因的氨基酸序列与桃中PpUGT78B的PSPG保守结构域进行氨基酸序列比对。发现有9个基因含有PSPG保守结构域,表明具有糖基转移酶活性,并且第44位氨基酸残基都是能够识别葡萄糖的谷氨酰胺Q(Gln),其中UG TA1-1比对的结果最高达到91%。
4.通过q-PCR测定12个基因在‘平邑甜茶’愈伤组织和苹果果皮的相对表达量,筛选出光培养‘平邑甜茶’愈伤组织的相对表达量显著高于苹果果皮的3个基因,分别为UGTA1-1、UGTA1-2和GlcAT14C。以候选基因在光培养‘平邑甜茶’愈伤组织中的相对表达量显著高于苹果愈伤组织为验证标准,发现只有GlcA T14C和UGTA1-1两个基因符合标准,但基因GlcAT14C中不含有PSPG保守结构域。初步认为UGTA1-1是矢车菊素-3-葡萄糖基转移酶的候选基因。