【摘 要】
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碱性蛋白酶具有酶活力高、性能优良、稳定性强等优点,在洗涤业、皮革制造业、食品行业及医药领域均有广泛应用,市场需求量也日益增加。通过对碱性蛋白酶生产菌株进行遗传改造、发酵条件优化等方法提高酶的产量、降低生产成本,具有重要的理论和实际应用价值。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）以较强的胞外蛋白分泌能力成为工业生产碱性蛋白酶的优选宿主菌之一。本课题以B.amyloli
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碱性蛋白酶具有酶活力高、性能优良、稳定性强等优点,在洗涤业、皮革制造业、食品行业及医药领域均有广泛应用,市场需求量也日益增加。通过对碱性蛋白酶生产菌株进行遗传改造、发酵条件优化等方法提高酶的产量、降低生产成本,具有重要的理论和实际应用价值。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）以较强的胞外蛋白分泌能力成为工业生产碱性蛋白酶的优选宿主菌之一。本课题以B.amyloliquefaciens TCCC 111018为出发菌株,通过敲除基因组上的胞外蛋白酶编码基因epr、vpr、mpr、apr、bpr和npr E,以减少它们对外源蛋白的降解作用。结果表明6种胞外蛋白酶的缺失不会影响菌体的生长,且npr E基因敲除后,能明显提高外源碱性蛋白酶的酶活力,与未缺失胞外蛋白酶的碱性蛋白酶生产菌B.amyloliquefaciens TCCC 111044相比,酶活力提高了7.5%。为了获得稳定的高产菌株,将外源碱性蛋白酶基因整合在基因组的不同位点,结果表明npr E基因位点的整合菌株111018-Δnpr E::apr E产生碱性蛋白酶的酶活力达到1289.09 U/m L,比原始菌株TCCC 111018提高了88.9%;Ori C附近yaah基因位点的整合菌株111018-Δyaah::apr E的碱性蛋白酶酶活力比TCCC 111018提高了15%。通过发酵上清液的SDS-PAGE分析和质谱鉴定,发现碱性蛋白酶生产菌TCCC111044的胞外α-淀粉酶表达量最高。考虑到大量的α-淀粉酶的胞外分泌表达会占用过多的资源,因此敲除α-淀粉酶编码基因amy E,但敲除菌株碱性蛋白酶的酶活力较TCCC 111018降低了41.8%。同时,在amy E基因位点整合apr E基因,保留amy E的启动子,所得菌株111018-Δamy E::apr E产生的碱性蛋白酶酶活力较TCCC 111018降低了23%;另外,将α-淀粉酶启动子更换为Npr E的启动子,在amy E基因位点继续整合apr E基因,获得的整合菌株111018-Δamy E::apr E*的碱性蛋白酶活力也没有显著提高,可能是由于敲除菌株或整合菌株不能充分利用发酵培养基中的碳源导致的。接下来,对整合菌株111018-Δamy E::apr E*/p LY-2的发酵培养基碳源进行了优化,分析碳源对碱性蛋白酶酶活力的影响,结果表明糊精和添加淀粉酶的玉米粉为碳源时效果较好,但考虑到生产成本,故采用酶法水解的玉米粉作为碳源。深入研究后得出90℃的液化时间对培养基的初始DE值无影响,而耐高温淀粉酶的添加量为正常添加量的5倍和8倍时,发酵液中的碱性蛋白酶活力最高,这为实际生产提供了理论参考。
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