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1.CD3/CD28体外诱导人T细胞表达Tn抗原的机制研究目的:通过CD3/CD28诱导T细胞体外活化后检测其表面Tn抗原表达的情况,探讨Cosmc基因对Tn抗原表达的影响及其调控机制。方法:选用来自烟台中心血站的30例健康成人抗凝血,Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMC),免疫磁珠分选获得纯化的CD3+T淋巴细胞,CD3/CD28活化T细胞12h,24h,36h,48h,60h,72h;流式细胞术检测活化前后不同时间段CD4+、CD8+T细胞表面Tn抗原表达的百分率,并对不同亚群T细胞表面Tn抗原的平均荧光强度进行统计学分析。RT-PCR,Western-blot分别检测Cosmc在基因转录与蛋白水平上的表达变化,荧光分析法检测各活化时间点T-synthase活性的改变;ELISA检测活化前后各时间点细胞培养上清中IL-4,IFN-γ的分泌情况;测序比对Cosmc编码区是否存在基因突变;BSP法检测活化前后Cosmc启动子的甲基化状态。结果:CD3/CD28活化T细胞表面均表达Tn抗原,并表现为时间依赖性。但Tn抗原的表达情况存在差异,Tn抗原的表达量高峰出现在活化后48h。Cosmc cDNA、Cosmc蛋白水平,T-synthase活性均随活化时间的延长而下降;且与Tn抗原表达水平呈负相关。随着活化时间的延长,IL-4的分泌水平先升高后下降,IFN-γ分泌水平与其相反;活化T细胞的Cosmc编码区未发生基因突变,但其启动子及SP1/SP3结合位点呈高甲基化。结论:CD3/CD28体外诱导T细胞活化后表达Tn抗原的机制可能是Cosmc启动子及SP1/3结合位点的高甲基化导致Cosmc转录与蛋白水平下降,进而间接调控Tn抗原的表达。2.Cell Stimulation Cocktail体外诱导T细胞表达Tn抗原的动态变化研究目的:探讨活化剂Cell Stimulation Cocktail体外诱导T细胞活化过程中,其表面Tn抗原的表达情况及其与Cosmc转录及蛋白表达水平之间的关系。方法:Ficoll密度梯度离心法分离健康人外周血单个核细胞(PBMC),免疫磁珠分选CD3+T细胞,加入T细胞活化剂Cell Stimulation Cocktail,置于37℃细胞培养箱中培养12h,24h,36h,48h,60h,72h。流式细胞术检测T细胞活化前后不同时间点T细胞中Tn+细胞的百分率及Tn抗原平均荧光强度;采用qPCR,RT-PCR,扩增Cosmc基因;Western-blot分别检测各活化时间点T细胞中Cosmc蛋白表达状况;荧光分析法检测活化各时间点T细胞中T-synthase的活性。结果:T细胞活化剂Cocktail活化T细胞致使其表面表达Tn抗原,且Tn+细胞的百分率随活化时间的延长先升高后降低。活化各时间点T细胞的Cosmc转录及蛋白水平、T-synthase活性均随活化时间延长呈先降低后升高的趋势,此变化与Tn抗原表达水平相反。结论:Cocktail刺激T细胞活化过程中Tn抗原表达呈动态变化,表达水平与Cosmc转录及蛋白水平下降、T-synthase活性降低密切相关。