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【背景】
动脉粥样硬化是一种多因素引起的慢性炎症性疾病。许多研究证实动脉粥样硬化斑块中存在细菌DNA，且约有50%是革兰氏阴性变形菌门，这表明持续性感染和炎症的结合可能在斑块的形成中起作用。但细菌感染影响动脉粥样硬化进展的相关机制仍不十分清楚。本实验室前期研究发现，许多革兰氏阴性菌的核心寡糖都能与C型凝集素受体DC-SIGN(CD209)或Langerin(CD207)相互作用。另外有研究表明在动脉粥样硬化斑块中有DC-SIGN的表达，而且在冠状动脉斑块中检测到能与奇异变形杆菌的外膜蛋白发生交叉反应的抗体。在本研究中，我们探究变形菌门中的奇异变形杆菌是否可以通过C型凝集素受体与冠状动脉粥样硬化斑块相互作用，进而影响疾病的发生发展。
【方法】
1奇异变形杆菌脂多糖的表型分析
1.1提纯细菌脂多糖，用SDS-PAGE银染法检测奇异变形杆菌的O抗原表达情况。
1.2利用PLA激活人纤维蛋白溶酶原的功能需要依赖粗糙型的脂多糖的特性，将表达PLA蛋白的质粒转入奇异变形杆菌，测定PLA的酶活功能从而进一步检测奇异变形杆菌的脂多糖表型。
2细胞侵袭实验
2.1CFDA-SE染料标记奇异变形杆菌，利用庆大霉素保护实验和流式细胞仪检测该菌侵袭表达CD209受体的小鼠原代腹腔巨噬细胞及不表达CD209受体的小鼠巨噬细胞系RAW264.7的能力。
2.2利用庆大霉素保护实验检测表达和不表达O抗原的奇异变形杆菌对稳定表达人CD209和CD207的CHO细胞(CHO-hDC-SIGN和CHO-hLangerin)的侵袭能力。
2.3利用庆大霉素保护实验检测奇异变形杆菌和CHO-hDC-SIGN、CHO-hLangerin之间的相互作用是否能被添加的甘露聚糖mannan、特异性人CD209抗体和CD207抗体所抑制。
3CD209及CD207受体在冠状动脉粥样硬化斑块中的表达及与巨噬细胞标志物的共定位
3.1将收集的新鲜斑块(实验组)及正常动脉(对照组)的样本挑选并切除一部分制成石蜡标本，用免疫组化的方法检测组织CD209及CD207受体的表达情况。
3.2免疫荧光双标染色检测斑块中CD209是否与巨噬细胞标志物CD68共定位。
4冠状动脉粥样硬化斑块组织的黏附实验
4.1将新鲜的斑块组织剪成1mm3，置于培养液中，加入表达和不表达O抗原的奇异变形杆菌检测对斑块组织的黏附能力。同时用细菌对正常动脉组织的黏附作为对照。
4.2检测奇异变形杆菌和斑块之间的相互作用是否能被添加的mannan和特异性人CD209抗体所抑制。
5冠状动脉粥样硬化斑块组织的细菌16SrDNA测序
以斑块组织扩增的细菌16SrDNA产物为模板制备测序文库，对16SrDNA的全长序列进行测序，以分析斑块中细菌组成。
6体内实验研究
将奇异变形杆菌经尾静脉注射感染载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)的动脉粥样硬化模型小鼠和野生型小鼠，分别于2、12、24和48小时后处死小鼠，分离心脏，分析细菌的播散能力。
【结果】
1本次研究使用的奇异变形杆菌是粗糙型菌株
SDS-PAGE银染及PLA蛋白的酶活实验显示奇异变形杆菌脂多糖的O抗原链缩短，可造成其核心寡糖的暴露。
2CD209和CD207是奇异变形杆菌的受体
2.1和RAW264.7细胞相比，奇异变形杆菌侵袭表达CD209受体的小鼠原代腹腔巨噬细胞更多，说明CD209可与奇异变形杆菌相互作用。
2.2和对照组CHO细胞相比，奇异变形杆菌侵袭CHO-hDC-SIGN和CHO-hLangerin细胞的能力更强。然而表达O抗原的奇异变形杆菌的侵袭能力较弱，这说明O抗原的表达降低了细菌与受体间的相互作用。同时，进一步验证奇异变形杆菌对表达受体的细胞的侵袭可以被抑制剂甘露聚糖、人CD209抗体和CD207抗体所阻碍。
3冠状动脉粥样硬化斑块表达的CD209受体主要在巨噬细胞表面
3.1免疫组化结果显示收集的斑块标本均表达CD209受体，然而仅有一例标本表达CD207受体。所有的正常动脉标本均不表达CD209及CD207。
3.2免疫荧光双标结果显示斑块标本中CD209与其巨噬细胞的标志物CD68共定位。
4奇异变形杆菌可通过CD209受体与冠状动脉粥样硬化斑块相互作用
和正常的动脉组织相比，奇异变形杆菌黏附斑块的能力更强。然而表达O抗原的奇异变形杆菌的黏附能力较弱，这说明O抗原的表达降低了细菌与斑块组织间的相互作用。同时，进一步验证奇异变形杆菌对斑块组织的黏附作用可以被抑制剂甘露聚糖、人CD209抗体所阻碍。
5本研究中一例冠状动脉粥样硬化斑块标本中含量最多的门是变形菌门
对两例斑块标本进行细菌16SrDNA测序，其中一例含量最多的门是变形菌门，另一例是厚壁菌门，这揭示了动脉粥样硬化发展过程中微生物组成的复杂性。
6奇异变形杆菌可随血流播散至ApoE-/-动脉粥样硬化模型小鼠的心脏
ApoE-/-小鼠和野生型小鼠经尾静脉注射感染奇异变形杆菌，2、12、24和48h后研磨小鼠心脏发现ApoE-/-小鼠有大量的细菌，且在24小时处达到峰值。然而野生型小鼠的心脏细菌数目较少。
【结论】
本研究证明在冠状动脉粥样硬化斑块上表达的人DC-SIGN(CD209)能够作为奇异变形杆菌的细胞受体，提示细菌定居于动脉粥样硬化斑块中引起炎症反应。
动脉粥样硬化是一种多因素引起的慢性炎症性疾病。许多研究证实动脉粥样硬化斑块中存在细菌DNA，且约有50%是革兰氏阴性变形菌门，这表明持续性感染和炎症的结合可能在斑块的形成中起作用。但细菌感染影响动脉粥样硬化进展的相关机制仍不十分清楚。本实验室前期研究发现，许多革兰氏阴性菌的核心寡糖都能与C型凝集素受体DC-SIGN(CD209)或Langerin(CD207)相互作用。另外有研究表明在动脉粥样硬化斑块中有DC-SIGN的表达，而且在冠状动脉斑块中检测到能与奇异变形杆菌的外膜蛋白发生交叉反应的抗体。在本研究中，我们探究变形菌门中的奇异变形杆菌是否可以通过C型凝集素受体与冠状动脉粥样硬化斑块相互作用，进而影响疾病的发生发展。
【方法】
1奇异变形杆菌脂多糖的表型分析
1.1提纯细菌脂多糖，用SDS-PAGE银染法检测奇异变形杆菌的O抗原表达情况。
1.2利用PLA激活人纤维蛋白溶酶原的功能需要依赖粗糙型的脂多糖的特性，将表达PLA蛋白的质粒转入奇异变形杆菌，测定PLA的酶活功能从而进一步检测奇异变形杆菌的脂多糖表型。
2细胞侵袭实验
2.1CFDA-SE染料标记奇异变形杆菌，利用庆大霉素保护实验和流式细胞仪检测该菌侵袭表达CD209受体的小鼠原代腹腔巨噬细胞及不表达CD209受体的小鼠巨噬细胞系RAW264.7的能力。
2.2利用庆大霉素保护实验检测表达和不表达O抗原的奇异变形杆菌对稳定表达人CD209和CD207的CHO细胞(CHO-hDC-SIGN和CHO-hLangerin)的侵袭能力。
2.3利用庆大霉素保护实验检测奇异变形杆菌和CHO-hDC-SIGN、CHO-hLangerin之间的相互作用是否能被添加的甘露聚糖mannan、特异性人CD209抗体和CD207抗体所抑制。
3CD209及CD207受体在冠状动脉粥样硬化斑块中的表达及与巨噬细胞标志物的共定位
3.1将收集的新鲜斑块(实验组)及正常动脉(对照组)的样本挑选并切除一部分制成石蜡标本，用免疫组化的方法检测组织CD209及CD207受体的表达情况。
3.2免疫荧光双标染色检测斑块中CD209是否与巨噬细胞标志物CD68共定位。
4冠状动脉粥样硬化斑块组织的黏附实验
4.1将新鲜的斑块组织剪成1mm3，置于培养液中，加入表达和不表达O抗原的奇异变形杆菌检测对斑块组织的黏附能力。同时用细菌对正常动脉组织的黏附作为对照。
4.2检测奇异变形杆菌和斑块之间的相互作用是否能被添加的mannan和特异性人CD209抗体所抑制。
5冠状动脉粥样硬化斑块组织的细菌16SrDNA测序
以斑块组织扩增的细菌16SrDNA产物为模板制备测序文库，对16SrDNA的全长序列进行测序，以分析斑块中细菌组成。
6体内实验研究
将奇异变形杆菌经尾静脉注射感染载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)的动脉粥样硬化模型小鼠和野生型小鼠，分别于2、12、24和48小时后处死小鼠，分离心脏，分析细菌的播散能力。
【结果】
1本次研究使用的奇异变形杆菌是粗糙型菌株
SDS-PAGE银染及PLA蛋白的酶活实验显示奇异变形杆菌脂多糖的O抗原链缩短，可造成其核心寡糖的暴露。
2CD209和CD207是奇异变形杆菌的受体
2.1和RAW264.7细胞相比，奇异变形杆菌侵袭表达CD209受体的小鼠原代腹腔巨噬细胞更多，说明CD209可与奇异变形杆菌相互作用。
2.2和对照组CHO细胞相比，奇异变形杆菌侵袭CHO-hDC-SIGN和CHO-hLangerin细胞的能力更强。然而表达O抗原的奇异变形杆菌的侵袭能力较弱，这说明O抗原的表达降低了细菌与受体间的相互作用。同时，进一步验证奇异变形杆菌对表达受体的细胞的侵袭可以被抑制剂甘露聚糖、人CD209抗体和CD207抗体所阻碍。
3冠状动脉粥样硬化斑块表达的CD209受体主要在巨噬细胞表面
3.1免疫组化结果显示收集的斑块标本均表达CD209受体，然而仅有一例标本表达CD207受体。所有的正常动脉标本均不表达CD209及CD207。
3.2免疫荧光双标结果显示斑块标本中CD209与其巨噬细胞的标志物CD68共定位。
4奇异变形杆菌可通过CD209受体与冠状动脉粥样硬化斑块相互作用
和正常的动脉组织相比，奇异变形杆菌黏附斑块的能力更强。然而表达O抗原的奇异变形杆菌的黏附能力较弱，这说明O抗原的表达降低了细菌与斑块组织间的相互作用。同时，进一步验证奇异变形杆菌对斑块组织的黏附作用可以被抑制剂甘露聚糖、人CD209抗体所阻碍。
5本研究中一例冠状动脉粥样硬化斑块标本中含量最多的门是变形菌门
对两例斑块标本进行细菌16SrDNA测序，其中一例含量最多的门是变形菌门，另一例是厚壁菌门，这揭示了动脉粥样硬化发展过程中微生物组成的复杂性。
6奇异变形杆菌可随血流播散至ApoE-/-动脉粥样硬化模型小鼠的心脏
ApoE-/-小鼠和野生型小鼠经尾静脉注射感染奇异变形杆菌，2、12、24和48h后研磨小鼠心脏发现ApoE-/-小鼠有大量的细菌，且在24小时处达到峰值。然而野生型小鼠的心脏细菌数目较少。
【结论】
本研究证明在冠状动脉粥样硬化斑块上表达的人DC-SIGN(CD209)能够作为奇异变形杆菌的细胞受体，提示细菌定居于动脉粥样硬化斑块中引起炎症反应。