论文部分内容阅读
实验目的:比较物理法和物理化学法制备脱细胞人软骨细胞外基质（humanarticular cartilage extracellular matrix，hACECM）的差异。通过筛选出的方法制备脱细胞人脐带细胞外基质（the human umbilical cord Wharton’s jelly extracellularmatrix, hWJECM）纳米材料和支架。观察hWJECM膜和hACECM膜对兔软骨种子细胞增殖和表型的影响。实验方法:用DNA&GAG定量，羟脯氨酸定量，细胞增殖和细胞毒性检测等方法来并比较物理法和物理化学法制备的人软骨细胞外基质。用MTT法测定这两种ECM对小鼠成纤维细胞的增殖反应以及这两种ECM的细胞毒性，最后选择了物理法作为本课题后续试验的脱细胞方法。将物理法制作的hACECM和hWJECM，配制成0.5%的浆料，分别铺于6孔细胞培养板和96孔细胞培养板，形成1mm厚的薄膜，以此培养板培养兔关节软骨细胞，为实验组（包括hACECM实验组和hWJECM实验组）；空白对照组培养板不经过任何处理，仅使用单纯培养液培养兔关节软骨细胞。通过倒置显微镜、甲苯胺蓝染色，DNA&GAG定量，羟脯氨酸定量，原子力学显微镜检测铺板后ECM的状态。分别于第5，10，15天，通过倒置显微镜、甲苯胺蓝染色，DNA&GAG定量，羟脯氨酸定量来评估兔软骨细胞接种在两种ECM膜上的生长形态、细胞表型维持和增殖情况。用CCK8法测试软骨细胞的增殖反应，来比较各组在第1、3、7、10天的增殖情况。实验结果:通过hochest33258染色发现差速梯度离心的hWJECM和hACECM脱细胞完全。脱细胞后的hWJECM和hACECM的甲苯胺蓝染色和番红O染色证实两种ECM里面含有大量的糖胺聚糖。扫描电镜可以发现两种ECM膜都有很多胶原纤维，hACECM的纤维排列平行，而hWJECM的排列杂乱。脱细胞后的hWJECM和hACECM的DNA&GAG定量、羟脯氨酸定量同天然的人软骨相比，脱细胞后DNA的量明显少于脱细胞前（P<0.05）。hWJECM和hACECM保留了大量的GAG和胶原。原子力学显微镜检测发现，铺板后的hWJECM的高度达500nm，hACECM高度达200nm，显示两种ECM都有很好的拓扑结构，应该会更适合软骨细胞的粘附。兔软骨种子细胞接种在铺有两种ECM的培养板上。倒置显微镜观察hWJECM组和hACECM组的兔软骨细胞在5，10，15天的细胞增殖情况明显好于空白对照组，15天的甲苯胺蓝染色的结果证实hWJECM组细胞数量明显多于其他两个组，CCK8细胞增殖试验第7，10天显示hWJECM组在细胞增殖方面明显地优于空白对照组（p=0.0001； p=0.0006）。CCK-8细胞增殖试验显示第7,10天hACECM组在细胞增殖方面明显地优于单纯培养液的对照组（P=0.0298<0.05，P<0.05）。培养于ECM10,15天的软骨细胞，DNA含量均明显高于空白对照组。培养于hACECM的又高于hWJECM的软骨细胞。结论:物理法脱细胞能够很彻底的脱去细胞及其碎片，并且很大程度的保留GAG和胶原。其细胞相容性优于物理化学法。这两种ECM对于软骨细胞扩增有很好的促进作用。因此，能很好地替代人软骨ECM作为组织工程软骨支架材料。人脐带ECM制成支架，其生物力学特性是否优于人软骨ECM，以及材料中GAG含量，胶原的类型和含量与其产生的生物力学强度关系，有待进一步研究。