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第一部分慢病毒介导的绿色荧光蛋白报告基因对人前列腺癌PC-3细胞的标记[目的]目前仍没有合适的方法标记人前列腺癌PC-3细胞,追踪观察肿瘤的转移情况。本实验旨在探讨慢病毒介导的绿色荧光蛋白(GFP)标记人前列腺癌PC-3细胞是否影响其细胞生物学特性,以及GFP基因能否持久稳定表达,为下一步实验奠定基础。[方法]常规肿瘤细胞培养、传代,在细胞状态最佳时以不同病毒感染复数(MOI)实行GFP慢病毒对PC-3的感染,7天后在荧光显微镜下观察GFP在PC-3的表达情况。选取感染GFP阳性表达率最高的孔继续培养传代至第三代后,分别用镜下形态观、MTT测生长曲线、划痕实验来对比两种细胞的形态、活性、生长速度和生长状态,以评价GFP基因在PC-3细胞表达的稳定性。[结果]置荧光显微镜下,转染72h后,部分PC-3细胞可见绿色荧光,转染一周时,绿色荧光表达最强。其中以MOI=20感染率最高,GFP阳性表达率为(92.3±1.2)%,GFP/PC-3在体外持续培养2、4、8周,GFP阳性率没有明显变化。镜下形态观、MTT测生长曲线、划痕实验等结果显示,与转染前相比,慢病毒感染PC-3后,对细胞活力、增殖、凋亡和周期均没有影响(P>0.05)。[结论]GFP慢病毒能够高效标记PC-3,并且不影响其生物学特性,GFP基因在PC-3细胞中能够持久稳定表达,可以用于下一步的细胞示踪研究。第二部分前列腺癌脊椎转移模型的建立[目的]将转染成功后稳定表达绿色荧光蛋白的前列腺癌PC-3细胞(文中称GFP/PC-3细胞)采用悬液注射于小鼠的下腔静脉,建立可在动物活体荧光成像系统下直接观察肿瘤生长及转移的简便、可靠的前列腺癌脊柱转移模型。[方法]1、3只4周-6周龄的雄性裸鼠,用细胞浓度为1×107个/ml的GFP/PC-3细胞悬液0.15ml行腋窝皮下注射。观察GFP/PC-3的活性和侵袭力。2、16只4周-6周龄的雄性裸鼠,在手术显微镜下暴露下腔静脉,用40ul的胰岛素注射针头抽取细胞浓度为1×107个/ml的GFP/PC-3细胞悬液0.15ml行下腔静脉注射。观察下腔静脉注射肿瘤细胞后裸鼠的存活率及3个月后肿瘤细胞的转移情况。[结果]1、皮下注射三只裸鼠一周后均可见有成瘤灶并能在活体荧光成像系统下观察到绿色荧光,两周后肿瘤生长迅速,8周后裸鼠呈恶病质状态,12周后死亡。2、下腔静脉注射裸鼠脊柱转移模型成活率为100%(16/16)；一周时活体荧光成像系统下可见3只腰背部有绿色荧光显像,四周时可见表达绿色荧光的肿瘤增大,肿瘤骨转移率为19%。(3/16)。3、三个月后脱颈处死荷瘤鼠,解剖后行大体观察,可见3只裸鼠腰椎有肿瘤浸润,与动物活体荧光成像系统结果一致,转移率约为19%(3/16)。4、病理学观察：大体病理：大体解剖发现腰椎有肿瘤转移,转移肿瘤块呈灰白色团块状隆起于腰椎表面。显微镜下观察：皮下种植肿瘤细胞排列紊乱,形态不规则,细胞分化差,核大深染；椎体转移瘤有反应性成骨显像。[结论]用绿色荧光蛋白标记的人前列腺癌PC-3细胞成功的建立了裸鼠脊柱骨转移模型,为进一步研究前列腺癌骨转移提供了一种简便、可行的新方法,对前列腺肿瘤治疗药物开发、肿瘤转移机制的干预、基因治疗等许多与临床密切联系的基础实验研究提供了帮助。