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桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)隶属于双翅目Diptera,实蝇科Tephritidae,果实蝇属Bactrocera,是重要的世界性检疫害虫。桔小实蝇繁殖能力强,成虫产卵产于果实内部,幼虫孵化后取食果实,造成烂果及落果,严重影响果实的食用价值和经济价值。卵巢作为昆虫雌性生殖系统的重要组织,与昆虫的繁衍有着直接关系,相关研究一直是昆虫发育领域的研究热点,是探索防控害虫新方法的重要切入点。谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione S-transferases,GSTs)是一类重要的超基因家族,目前对昆虫GSTs研究主要集中在参与解毒代谢介导抗性形成方面,对其它生理功能的研究较少。本学位论文基于桔小实蝇基因组和转录组数据,鉴定桔小实蝇GST基因;利用组织表达谱筛选到两个在卵巢高表达的GST(BdGSTe1和BdGSTe10);克隆获得了它们的开放阅读框序列并进行序列分析;通过构建p ET-28a(+)原核表达载体,表达了BdGSTe1和BdGSTe10的重组蛋白;利用RT-qPCR技术解析了BdGSTe1和BdGSTe10的时空表达模式;最后通过RNAi技术探究了BdGSTe1和BdGSTe10在桔小实蝇卵巢发育过程中的生理功能。本研究成果将丰富对昆虫GSTs功能的认识,明确GSTs家族基因的功能多态性,为桔小实蝇防治特异性和环境友好型杀虫剂研发提供靶标及理论基础。本学位论文主要研究结果如下:1桔小实蝇BdGSTe1和BdGSTe10的筛选和鉴定基于桔小实蝇的基因组以及其不同发育阶段和组织转录组数据,共鉴定得到34个GSTs基因,包括3个微粒体型GSTs和31个胞质型GSTs,其中9个为新发现的GSTs。利用RT-qPCR技术分析BdGSTs在桔小实蝇成虫不同组织的表达谱,发现BdGSTe1和BdGSTe10在桔小实蝇成虫卵巢高表达,特别是BdGSTe1,具有很高的组织特异性。2桔小实蝇BdGSTe1和BdGSTe10的克隆及原核表达利用RT-PCR技术,克隆得到桔小实蝇BdGSTe10的开放阅读框,长度为669bp,编码222个氨基酸。利用NCBI在线工具对其分析序列,结果表明BdGSTe1和BdGSTe10均包含氮端的5个G-side(GSH结合位点)和碳端的9个H-side(疏水物质结合位点),其中包含delta和epsilon家族特有的高度保守的Ser12,暗示这两个基因是具有活性的GSTs。BdGSTe1选取BamHI和EcoRI作为酶切位点,BdGSTe10选取Bam HI和Sal I作为酶切位点,采用DNA重组技术,构建BdGSTe1-p ET-28a(+)和BdGSTe10-p ET-28a(+)原核表达载体。经IPTG诱导后表达BdGSTe1和BdGSTe10重组蛋白,SDSPAG电泳显示纯化后的重组蛋白在25k Da附近有一条特异的蛋白质条带,酶学特性分析结果表明两个重组蛋白均具有GST活性。3桔小实蝇BdGSTe1和BdGSTe10的时空表达模式解析利用RT-qPCR技术,解析BdGSTe1和BdGSTe10在各发育时期的表达模式,结果表明,两个基因均在卵期和雌成虫期高表达。在成虫期,BdGSTe1和BdGSTe10在雌成虫性成熟过程中表达量逐渐上升。组织定量结果表明,两个基因在卵巢中表达量最高,暗示其可能参与调控桔小实蝇雌成虫的生殖过程。分析BdGSTe1和BdGSTe10在桔小实蝇卵产后胚胎发育过程中的表达情况显示,两个基因均在初产卵中表达量最高,随着胚胎发育表达量逐渐降低,暗示其在胚胎发育过程中也具有重要作用。4 BdGSTe1和BdGSTe10参与桔小实蝇卵巢发育功能解析体外合成基因特异性dsRNA,采用饲喂法沉默靶基因,BdGSTe1和BdGSTe10均能被有效沉默,沉默效率分别达到41%和65%。干扰两个基因表达后,桔小实蝇卵巢发育迟缓,直径变小;与同日龄野生型雄虫交配后其产卵量显著下降。BdGSTe1和BdGSTe10基因表达受抑制后卵巢发育重要基因Bd Vg1和Bd Vg3的表达量显著降低,说明BdGSTe1和BdGSTe10参与调控桔小实蝇卵巢发育。沉默BdGSTe1和BdGSTe10后桔小实蝇卵巢中活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平升高,推测桔小实蝇BdGSTe1和BdGSTe10可能发挥抗氧化作用,参与维持卵巢ROS动态平衡。