芭蕉是江南园林的代表性植物，野生蕉作为新兴的芭蕉类观赏植物应用日益受到重视。福建省分布有丰富的野生蕉资源，各地野生蕉在形态特征和生长发育习性上均有不同程度的差异。福建省是野生蕉分布的北缘区域，新近发现的大规模野生蕉资源分布，对于研究芭蕉属植物的起源与进化有重要的价值。同时，野生蕉抗性强，特别是其抗寒性的特点，不仅本身可以直接应用于容易受冻地区的园林绿化，而且可以从中挖掘抗寒等抗性基因资源，用于改良不耐寒的芭蕉属观赏植物，拓展观赏芭蕉植物的应用范围，使较寒冷的地区也可以种植展示南国风光的标志性植物。但是，目前福建野生蕉资源的研究还很少，因此有必要采用现代生物技术手段进行野生蕉的研究。本研究拟以福州宦溪野生蕉、三明野生蕉等福建野生蕉为材料，进行离体培养、基因克隆及其在低温下的qPCR分析，为其开发利用提供技术支撑或科学依据。主要结果如下：1福建野生蕉资源的离体繁殖研究根据Smmonds&Shepherd（1955）的评分方法，福州宦溪野生蕉属于AB类群，但比较接近AA类群，与福建其他地区的野生蕉（福州野生蕉的AA类群和三明野生蕉的AB类群）有一定的亲缘关系，但又有明显差别，增加了福建野生蕉资源的遗传多样性。本研究首先以福州宦溪野生蕉、福州北峰野生蕉的吸芽为外植体，建立了离体繁殖的无菌体系。30d进行观察统计，福州宦溪野生蕉、福州北峰野生蕉的不定芽诱导率达75%。其次，利用本实验室已继代保存的三明野生蕉试管苗进行增殖条件的优化。①比较不同光质（红光、蓝光、绿光、白光）、不同光强（0Lx、500Lx、1000Lx、1500Lx，白光）对三明野生蕉小苗增殖的影响，结果表明：在白光、1000Lx光照强度下，三明野生蕉试管苗的增殖效果最好。②在MS培养基上添加NAA（0mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L）、6-BA（2mg/L、4mg/L、6mg/L）、Ad（0mg/L、15mg/L、30mg/L）不同组合的生长调节剂的3因素3水平正交试验结果表明：对三明野生蕉小苗增殖影响程度依次为Ad＞6-BA＞NAA，在MS+NAA0.1mg/L+6-BA4mg/L+Ad30mg/L培养基（处理5）中增殖效果最好。③在MS培养基上添加NAA（0mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L）、6-BA（0mg/L、2mg/L、4mg/L）、Ad（15mg/L、30mg/L、45mg/L）不同组合生长调节剂的3因素3水平的正交试验表明：生长调节剂对三明野生蕉小苗薄层切片增殖影响程度依次为6-BA＞Ad＞NAA，三明野生蕉小苗薄层切片在MS+NAA0.2mg/L+Ad30mg/L培养基（处理4）中小苗不定芽增殖数最多，且苗高较高。④在MS培养基上添加NAA（0mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L）、6-BA（2mg/L、4mg/L、6mg/L）、Ad（0mg/L、15mg/L、30mg/L）不同组合的生长调节剂的3因素3水平的正交试验表明：生长调节剂对三明野生蕉类原球茎（多芽体）增殖影响程度依次为Ad＞NAA＞6-BA，MS+6-BA6mg/L+Ad30mg/L（处理3）最适合三明野生蕉类原球茎（多芽体）的增殖；生长调节剂对三明野生蕉类原球茎（大芽）增殖影响程度依次为NAA＞6-BA＞Ad，MS+NAA0.2mg/L+6-BA4mg/L （处理8）最适合三明野生蕉类原球茎（大芽）的增殖。以三明野生蕉小苗增殖的优化条件进行不同基因型野生蕉资源增殖比较的结果表明：三明野生蕉小苗的优化增殖条件也适合福州宦溪野生蕉、福州北峰野生蕉。最后，以三明野生蕉、福州宦溪野生蕉、福州北峰野生蕉的试管苗为材料进行生根研究，结果表明：NAA0.4mg/L对野生蕉试管苗的生根效果好，在泥炭土、园土、沙土（1:1:0.5）的混合基质中成活率达到94%。2福建野生蕉抗寒等抗性基因的分离以福州宦溪野生蕉（M. acuminata, AB group）叶片为材料提取总RNA，利用RT-PCR、RACE法，并参考马来西亚小果野蕉（M. acuminata, AA group）全基因组测序数据库，从福州宦溪野生蕉叶片中分离抗寒等抗性基因cDNA及DNA序列，共得到福州宦溪野生蕉抗寒关键基因CBF等基因cDNA及DNA全长序列20条，包括CDPK抗寒途径中的主要抗寒基因CBF(CBF7-1)、ICE1（ICE1-1、ICE1-2、ICE1-3、 ICE1-4、 ICE1-5、ICE1-6）、HOS1共8条cDNA全长序列,抗性胁迫“总分子开关”基因KIN10的6个成员（KIN10-1、KIN10-2、KIN10-3、KIN10-4、KIN10-5、KIN10-6），抗性基因CHUP1、PSAG1、PSAG23条cDNA全长序列，以及抗性基因CHUP1、PSAG1、PSAG23条编码区DNA序列（GenBank登录号分别为：CBF7-1：KC157575；ICE1-1~6：KC157569、KC157570、KC157571、KC157572、KC157573、 KC157574；HOS1：JX678611；KIN10-1~6：KC127685、KC127686、 KC127687、KC127688、 KC127689、KC127690；PSAG1cDNA：JX317082、PSAG2cDNA：JX317083；PSAG1DNA： JX678610、PSAG2DNA：JX678609；CHUP1cDNA：JX123753、CHUP1DNA：JX880084）。福州宦溪野生蕉CHUP1编码区基因组序列含有8个内含子、9个外显子，马来西亚小果野蕉基因组测序公布的CHUP1编码区基因组序列含有11个内含子、12个外显子，两者相差较大。福州宦溪野生蕉PSAG1、PSAG2基因组不含有内含子。3福建野生蕉抗性基因的生物信息学分析生物信息学分析表明：①福州宦溪野生蕉CBF7-1蛋白属于稳定、亲水蛋白；具有信号肽，由亚细胞定位推测福州宦溪野生蕉CBF7-1定位在细胞核中；共有8个磷酸化位点；CBF7-1具有CBF典型的AP2/ERF domain保守结构域。②福州宦溪野生蕉ICE16个成员均属于不稳定、亲水蛋白；不具有信号肽，由亚细胞定位推测福州宦溪野生蕉ICE1s定位在细胞核中；ICE16个成员磷酸化位点总数不等，介于20-30之间；ICE1的6个成员均具有ICE1特有的Helix-loop-helix保守结构域。③福州宦溪野生蕉HOS1属于不稳定、亲水蛋白；不具有信号肽，由亚细胞定位推测福州宦溪野生蕉HOS1定位在细胞核中；共有57个磷酸化位点；具有ELYS-like特征保守结构域。④福州宦溪野生蕉KIN10属于稳定、亲水蛋白；由亚细胞定位推测福州宦溪野生蕉KIN10s定位于细胞核或质膜；KIN106个成员磷酸化位点总数不等，介于21-26之间；KIN106个成员有多达10-13个保守结构域，很罕见，表明了其独特的多样性功能；同时，我们还发现KIN10的保守结构域多数为蛋白激酶结构域，是其发挥植物胁迫调控“总开关”的分子结构基础。⑤福州宦溪野生蕉CHUP1属于不稳定、亲水蛋白；具有信号肽、为双向跨膜螺旋；共有62个磷酸化位点，有3个保守结构域：Actin-binding FH2保守结构域、SF0亚家族结构域和SignalP-NN（euk）信号肽。Actin-bindingFH2保守结构域参与叶绿体移动的信号转导过程。⑥福州宦溪野生蕉PSAG1、PSAG2属于稳定、亲水蛋白；不具有信号肽、为跨膜蛋白，定位在微体或叶绿体；各有4个磷酸化位点；含有有一个光系统I的K亚基超家族保守结构域。两个PSAG成员的核苷酸序列及氨基酸序列都同源性高，且蛋白的三级结构也差异不大，这种基因的功能冗余进一步保证了PSAG功能上的稳定性。4福建野生蕉抗寒基因的荧光定量表达分析低温能够诱导植物许多基因的表达，从而使植物具有抗寒性。对福州宦溪野生蕉组培苗进行0℃、4℃、13℃、20℃、28℃温度处理，采用SYBR Green荧光定量PCR方法，检测宦溪野生蕉抗寒相关基因CBF7-1、ICE1s（ICE1-1~ICE1-4）、HOS1、KIN10s在低温胁迫处理下的相对表达量，以验证宦溪野生蕉中这些抗寒性基因的功能。研究结果表明：在13℃，KIN10s、ICE1s的表达量显著上调，均达到最高值，表明在普通香蕉停止生长的13℃，野生蕉体内抗寒信号转导途径中上游基因KIN10s和ICE1s因得到了大量的表达，以提高植株的抗寒性。同时，我们还发现，HOS1虽然在13℃比20℃有微量升高，但在继续降温时，表达量剧激下降。在0℃时，HOS1表达量降到最低值，这时候ICE1表达量明显回升。HOS1对ICE1有负调控作用，HOS1的下降有助于提高ICE1的水平，从而植物植物的抗寒性。这是它们之间表达模式上的差异，也符合CBF抗寒途径相关基因的表达特征。本研究中，宦溪野生蕉的CBF7-1的表达模式与KIN10s、ICE1s、HOS1不同，总体上随着温度的降低而表达量下降，但在0℃时反而又升高。综上所述，福州宦溪野生蕉CBF途径抗寒基因表达的可能分子机制为：当福州宦溪野生蕉受到低温胁迫时，特别是到了生长临界温度13℃时，KIN10s表达量增加，启动抗寒胁迫反应的“基因网络”，通过CBF信号转导途径，首先促使ICE1基因的表达量增加，推测ICE1通过CBF的信号转导，进一步促使COR基因的表达，从而提高福州宦溪野生蕉的抗寒性。而福州宦溪野生蕉在低温时HOS1表达量剧激下降，有助于提高ICE1的水平，促进COR的表达。