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水稻种子在胚乳中积累了大量的贮藏蛋白,其中以谷蛋白的含量居多,约占总蛋白的80％,且易于被人体消化吸收,是人类重要的蛋白质营养来源。任何对谷蛋白含量和组成的改变均会引起稻米品质的变化,开展谷蛋白相关的研究具有着重要的意义。水稻谷蛋白首先在内质网表面以57 kD前体的形式合成,再转运至蛋白贮藏液泡中,最终大量的前体裂解为成熟的37-39 kD酸性亚基和22-23 kD碱性亚基。任一谷蛋白转运途径的缺陷都有可能导致谷蛋白前体的大量积累,形成高含量的57 kD谷蛋白突变体,即57H(high amount of57 kD)突变体,因此,该类型的突变体是研究谷蛋白调控机制的重要材料。通过种质资源的筛选我们获得了一份57H自然突变体细老鼠牙,本论文对其研究情况进行了报道。此外,还对低谷蛋白含量Lgc1基因设计了用于分子辅助选择的标记。主要研究结果如下:
1.种子总蛋白的SDS-PAGE电泳图谱表明,与野生型水稻品种相比,突变体细老鼠牙积累了大量的57 kD谷蛋白前体,而成熟的酸性亚基和碱性亚基明显减少。另外,细老鼠牙的13 kD醇溶蛋白也大幅度增加。
2.将细老鼠牙分别与广亲和的粳稻品种02428和常规粳稻品种武运粳7号进行正反交,F1种子总蛋白表现为野生型,4个F2群体中中野生型与突变型呈3:1的分离比例。以上结果表明,突变体细老鼠牙的57H突变性状受一对隐性基因控制,暂命名为glup-t基因。
3.以细老鼠牙/02428的F2植株作为定位群体。通过F2种子总蛋白的SDS-PAGE电泳筛选隐性单株组成定位群体。随机选取92个隐性单株,应用SSR标记,将细老鼠牙的57H突变基因glup-t初步定位于第4染色体长臂上的SSR标记RM3735和RM5714之间,遗传距离分别为2.22 cM和2.81 cM。
4.为了进一步精细定位突变基因,先后开发了新的SSR、Indel及CAPS标记,并将定位群体放大到388个隐性单株,最终将glup-t基因精细定位于第4染色体长臂的BAC克隆OSJNBa0091D06上的Indel4—7、Indel4-8和CAPS4-3之间,标记与目标基因的遗传距离均为0.26 cM,覆盖约115 kb的物理距离。候选基因序列对比发现,glup-t基因可能与glup-3/osvpe1等位；测序表明,均是发生了单核苷酸的突变,但glup-t的突变位点与它们的不同。在glup-t中,突变位置为第275位的丝氨酸变为天门冬酰胺。可见,glup-t是glup-3/osvpe1的一个新等位基因。根据突变体glup-t与野生型存在的单核苷酸差异,设计了由三个引物组成的PCR扩增反应体系,经检测可区分出突变型、野生型及杂合型,可将其用于glup-t基因的分子标记辅助选择。
5.低谷蛋白稻米是肾脏病人较有效的食疗辅助品,培育低谷蛋白功能性水稻品种具有重大的意义。低谷蛋白含量Lgc1基因作为培育低谷蛋白功能性水稻品种的优质资源,受到了育种家的青睐。为提高Lgc1基因分子标记辅助选择的准确性,我们根据其突变体在两个谷蛋白基因GluB-4和GluB-5间的碱基缺失,设计出了Lgc1的2个插入缺失标记Indel-Lgc1-A和Indel-Lgc1-B。利用Indel标记对W3660(Lgc1低谷蛋白品种)/南粳46(谷蛋白正常品种)的F2分离群体和其他12份谷蛋白正常水稻品种进行检测验证。依据其PCR扩增产物的电泳带型,可准确地区分出低谷蛋白纯合基因型、谷蛋白正常纯合基因型和杂合基因型3种带型,且3种带型与其植株或品种相应的蛋白性状表现完全一致,表明这两个Indel标记可用于Lgc1基因的鉴定以及分子辅助育种。