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背景和目的:随着生活水平的逐步提高,世界范围内肥胖人群数量正在不断扩大。肥胖主要是由于能量的摄入大于消耗所致,因此有效地消耗能量对防治肥胖至关重要。人体内存在两种脂肪组织,一种为主要负责能量储存的白色脂肪组织(White Adipose Tissue,WAT),另一种为主要负责能量消耗的棕色脂肪组织(Brown Adipose Tissue,BAT)。近年发现BAT除存在啮齿类动物和婴儿体内,在成人体内也发现具有功能的BAT。慢性寒冷刺激可激活BAT中的线粒体解耦连蛋白1(Uncoupling Protein 1,UCP1)促进产热增加,减少脂肪的堆积。因此,激活棕色脂肪产热增加的策略及其分子机制的研究对防治肥胖有重要的意义。哺乳动物体内存在多种感受外界温度变化的温度敏感性瞬时受体电位通道(Thermosensitive Transient Receptor Potential,Thermo-TRP)。其中,瞬时受体电位通道M8亚型(TRPM8)能被低温(<27°C)和薄荷醇所激活,也被称为“冷通道”。TRPM8是一种非选择性阳离子通道,对Ca2+和Na+等阳离子敏感,广泛表达在温度和疼痛感觉神经元。近年研究发现在小鼠棕色脂肪中也有TRPM8表达,TRPM8基因敲除小鼠对寒冷刺激不敏感,说明TRPM8对感知外界温度起到重要作用。薄荷醇是常用的调味品和添加剂,也是TRPM8天然的激动剂。我们既往研究发现在血管组织也存在TRPM8表达,薄荷醇激活血管TRPM8可抑制血管收缩,降低血压。据报道棕色脂肪组织也有TRPM8表达,但其生理意义还不清楚。因此,我们推测激活棕色脂肪TRPM8可能与能量代谢和产热增加有关。棕色脂肪的线粒体UCP1在氧化呼吸链解偶联中发挥重要作用,与棕色脂肪产热有关。因此,我们提出理论假设,薄荷醇通过激活TRPM8通过细胞内Ca2+变化影响UCP1及其相关分子的表达,促进棕色脂肪产热增加,从而预防肥胖。为了验证上述理论假设,本研究分为三部分进行。第一部分:通过蛋白免疫印迹和免疫荧光染色证实TRPM8及UCP1在小鼠棕色脂肪组织和棕色脂肪细胞的表达,明确其分布以及薄荷醇干预对其表达的影响。通过检测薄荷醇激活棕色脂肪细胞内钙离子浓度([ca2+]i)变化,明确棕色脂肪细胞上的trpm8通道是否具有功能。第二部分:通过长期薄荷醇干预c57/bl6j野生型小鼠和trpm8基因敲除型小鼠,观察trpm8激活后对小鼠自主活动度、核心体温、动态心率及体重等能量代谢相关表型的影响。通过建立高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型,证实长期薄荷醇干预对肥胖小鼠能量代谢及糖耐量的影响。进一步证实trpm8在调节棕色脂肪产热中的关键作用。第三部分:通过对介导bat产热的蛋白激酶(pka、ampk、pi3k)及调控bat增殖、分化转录因子(pgc-1,bmp7、pparγ)和棕色脂肪细胞内[ca2+]i的干预,阐明薄荷醇激活棕色脂肪trpm8调节ucp1产热的具体机制。材料与方法:实验分为离体和在体两部分。离体实验以原代培养的野生型小鼠(wt)和trpm8基因敲除小鼠棕色脂肪细胞为主要研究对象,探讨薄荷醇对ucp1的激活作用及分子机制。动物实验以野生型小鼠、trpm8-/-和ucp1-/-小鼠为主要研究对象,分别进行膳食饲料干预,分为:普通饲料(chow)、普通+薄荷醇饲料(chow+m)、高脂饲料(hfd)和高脂+薄荷醇饲料(hfd+m)。膳食干预28周后进行相应生理生化指标检测,研究薄荷醇对小鼠体重、能量代谢及糖耐量的影响。实验方法:1.常规方法检测小鼠体重、进食量、大便排泄量、肛温、糖耐量、胰岛素耐量等情况。2.采用植入子无线遥测小鼠24h自主活动度、核心体温、动态心率。3.采用蛋白免疫印迹法检测野生型及基因敲除小鼠棕色脂肪组织和原代培养棕色脂肪细胞中trpm8、ucp1、pgc-1、ppka、pparγ和bmp7的蛋白表达。4.采用比率荧光成像系统检测薄荷醇干预后野生型和基因敲除小鼠棕色脂肪细胞[ca2+]i的变化。5.采用小动物呼吸检测系统监测小鼠静息耗氧量。6.采用免疫荧光检测技术观察trpm8、ucp1在棕色脂肪组织及细胞中表达。7.采用免疫酶联吸附技术检测野生型小鼠血浆甲状腺激素、胰岛素水平等。结果:1.小鼠棕色脂肪细胞存在trpm8和ucp1表达,且trpm8和ucp1共表达于棕色脂肪细胞。2.薄荷醇可以激活棕色脂肪细胞trpm8,促进[ca2+]i增加,但trpm8-/-小鼠棕色脂肪细胞没有明显变化。3.薄荷醇干预WT小鼠棕色脂肪细胞可以剂量依赖性上调UCP1表达,TRPM8-/-小鼠棕色脂肪细胞没有明显变化。4.长期薄荷醇干预明显增加WT小鼠的24h自主活动度、肛门温度、24h核心体温、氧耗量,但对TRPM8-/-小鼠没有明显影响。5.长期薄荷醇干预降低高脂饮食诱导肥胖WT小鼠体重,明显增加其24h核心体温、氧耗量,改善糖耐量及胰岛素耐量,但对TRPM8-/-小鼠没有明显影响。6.长期薄荷醇干预增加WT小鼠和高脂饮食诱导的肥胖WT小鼠棕色脂肪组织UCP1表达,但对TRPM8-/-小鼠没有明显影响。7.长期薄荷醇干预对UCP1-/-小鼠的24h核心体温没有影响。8.长期薄荷醇干预对高脂饮食诱导肥胖WT小鼠24h自主活动度、血浆胰岛素水平、24h心率、甲状腺激素水平没有影响。9.长期薄荷醇干预不能影响小鼠摄食及排便量。10.长期薄荷醇干预不能影响小鼠棕色脂肪PGC-1、BMP7、PPARγ表达。11.薄荷醇促进棕色脂肪细胞PKA磷酸化上调UCP1表达。12.给予钙离子螯合剂可以明显抑制薄荷醇对UCP1的调节作用,但β肾上腺素受体没有此作用。结论:1.棕色脂肪细胞存在TRPM8表达,薄荷醇激活小鼠棕色脂肪细胞TRPM8,增加棕色脂肪细胞内[Ca2+]i,薄荷醇可上调UCP1表达。2.长期薄荷醇干预可以模拟TRPM8依赖的慢性寒冷刺激,增加小鼠24h核心体温、基础代谢及自主活动。3.长期膳食薄荷醇干预可以预防野生型小鼠高脂饮食诱导肥胖和糖耐量异常。薄荷醇激活棕色脂肪TRPM8通过Ca2+依赖性PKA磷酸化调节UCP1表达,促进产热增加。