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【研究背景】叉头状转录因子3(FOXP3)属于FOX蛋白家族成员,具有标志性的叉头状DNA结合结构域。作为调节性T细胞(Treg)的标志性分子,FOXP3在Treg的分化和发育过程中发挥着重要的作用。近年来大量研究发现,FOXP3也表达于正常乳腺上皮细胞中,并且其表达缺失或突变是导致乳腺癌发生发展的重要因素。作为一个重要的抑癌基因,FOXP3主要通过调控乳腺癌发生发展相关基因的表达来发挥其抑癌功能。然而我们的前期研究结果显示,部分乳腺癌细胞中依然存在野生型FOXP3的表达,这提示在这些乳腺癌细胞中FOXP3的功能可能受到了抑制,无法发挥抑癌作用,最终导致肿瘤的发生发展。可目前仍不清楚导致FOXP3抑癌功能丧失的机制。【研究目的】本研究拟通过对乳腺癌临床样本分析、体外细胞学实验以及生物信息学分析,系统阐明导致乳腺癌中FOXP3抑癌功能丧失的原因及其分子机制,完善FOXP3在乳腺癌发生发展中的作用,为乳腺癌的FOXP3基因治疗提供理论基础。【研究方法】1.收集乳腺癌临床标本,检测FOXP3在乳腺癌细胞中的表达及定位情况;2.通过免疫共沉淀实验(Co-IP)、荧光共振能量转移实验(FRET)等系统验证FOXP3能与Gal-1相互作用;3.通过生物信息学分析模拟FOXP3与Gal-1的相互作用,预测FOXP3与Gal-1的相互作用位点,随后构建相应的截短体和突变体,通过Co-IP实验确定FOXP3与Gal-1的相互作用位点;4.构建FOXP3过表达的MDA-MB-231细胞,并向细胞内转染Gal-1,运用ChIPSeq实验,从全基因组的角度检测FOXP3对靶基因的调控是否受FOXP3-Gal-1相互作用的影响,并运用real time PCR和ELISA在转录和翻译水平对测序结果进行验证;5.构建过表达Gal-1或Gal-1突变体的乳腺癌细胞株,利用xCELLigence RTCA以及Transwell实验,分析FOXP3与Gal-1的相互作用对FOXP3抑癌功能的影响;6.选取FOXP3阳性的乳腺癌组织以及配对的癌旁组织,通过免疫组化实验观察Gal-1在乳腺癌细胞中的表达情况;7.对乳腺癌细胞进行3D培养,通过免疫荧光实验检测乳糖及乳腺癌细胞酸性培养基对Gal-1亚细胞定位的影响;8.对乳腺癌细胞酸性培养基中唾液酸的含量进行检测,探讨Gal-1在乳腺癌细胞核内高表达的原因。【研究结果】1.临床样本分析显示FOXP3在32.1%(53/165)的乳腺癌标本中呈细胞核表达;2.FOXP3与Gal-1在乳腺癌细胞中能够发生相互作用,且它们的相互作用主要位于细胞核内;3.FOXP3通过其FKH结构域与Gal-1的N-端3-10氨基酸区域结合;4.ChIP-Seq结果显示,FOXP3主要结合于靶基因的启动子区域,且其靶基因多为一些参与肿瘤相关通路的基因;而当过表达Gal-1后,FOXP3能够结合到的靶基因数量显著减少;5.FOXP3与Gal-1的相互作用减弱了FOXP3对乳腺癌细胞增殖、侵袭能力的抑制作用;6.在乳腺癌组织中,Gal-1主要表达于乳腺癌细胞的胞核内,而在癌旁组织中,Gal-1主要表达于乳腺癌细胞的胞质或组织间隙;7.乳腺癌细胞3D培养结合免疫荧光实验显示乳糖可以诱导乳腺癌细胞中Gal-1的亚细胞定位由细胞核向细胞质的改变,而乳腺癌细胞酸性培养基的加入则阻断了上述过程使得Gal-1在细胞核内大量聚集;8.乳腺癌细胞酸性培养基中唾液酸的含量显著增高。【结论】1.本研究系统证实FOXP3能够与Gal-1相互作用,且分别是FOXP3的FKH结构域和Gal-1的N端3-10氨基酸区域介导了它们的相互作用;2.FOXP3主要通过其FKH结构域发挥抑癌作用,而Gal-1会与FOXP3的FKH结构域结合,导致FOXP3丧失对相关靶基因的调控作用;3.FOXP3与Gal-1的相互作用能够抑制FOXP3对乳腺癌细胞生长、转移的抑制作用;4.乳腺癌组织中的酸性微环境导致Gal-1在细胞核内的聚集,而细胞核内过多的Gal-1会与FOXP3相互作用,进而抑制FOXP3的抑癌功能。