非天然手性氨基酸做为小分子探针和重要的药物前体,已经被广泛地应用于生物学研究、手性农药、食品添加剂和手性药物等领域。已有的化学合成方法存在工艺复杂、收率低、成本高及污染严重等问题。转氨酶具有较宽的底物特异性,较快的催化速度,高对映选择性和立体选择性和无需辅酶的再生等这些特性,使得该酶成为重要的生物催化剂,越来越广泛地应用于非天然氨基酸的制备合成。本项目通过构建一个以大肠杆菌芳香族氨基酸转氨酶(AroAT)为主的多酶反应体系,在水相-有机相双相介质中,不对称催化合成非天然氨基酸。此方法旨在消除/减少转氨酶酶促反应中的种种弊端,优化反应条件和过程,最大限度地提高酶的生物催化效率。本研究进行了以下方面的研究:1)表达纯化大肠杆菌芳香族氨基酸转氨酶(AroAT)以及偶联酶,来自发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)的α-酮戊二酸脱氢酶(HGDH),并测定转氨酶在水相介质中催化非天然氨基酸的酶动力学常数。实验结果显示:AroAT具有很强的合成L-苯丙氨酸衍生物的能力,如L-2-氟苯丙氨酸、L-4-氟苯丙氨酸和L-4-甲氧基苯丙氨酸。苯丙酮酸的邻取代衍生物:2-氟苯丙酮酸是一种良好的底物,其活性只比与天然底物4-羟基苯丙酮酸略低。用甲氧基取代4-羟基苯丙酮酸苯环对位的羟基,会使活性降低31%,而用氟基取代则使活性降低61%。2)研究酶在有机/水相两相中的耐受性。实验结果发现:在酶偶联体系中加入双倍浓度的HGDH能弥补由于10%乙醇造成的活力降低的问题。且在10%的乙醇的存在下,AroAT对于天然底物4-羟基苯丙酮酸的整体催化效率(kcat/Km)提高了 50%,而对于底物4-甲氧基苯丙酮酸的整体催化效率下降了 15.4%。3)测定多酶反应体系催化合成的最终产物的转化率和光学纯度。以100 mML-谷氨酸、4 mM 4-羟基苯基丙酮酸为底物,体系中加入偶联酶HGDH和乙醇脱氢酶ADH,和10%乙醇,反应2小时,最终能获得产物L-酪氨酸(产率为85.3%,ee值大于99%)。在完成了多酶反应体系的构建和体系在有机溶剂/水两相中的应用后,为了进一步的研究微生物在生物降解领域的应用以及研究与甲苯的合成与分解相关的酶,针对甲苯降解菌进行筛选,鉴定,对其降解特性进行了初步研究。甲苯在化工业、医药行业中作为合成原料起着至关重要的作用。与此同时,甲苯也是一种常见的污染物,它能污染土壤和水源,对人的身体健康造成影响。传统降解甲苯的方法费时费力,还会造成二次污染。微生物法降解甲苯不仅效果优良而且成本低廉,因此有着巨大的应用价值和研究前景。本论文从化工厂排污口分离出了多株能降解甲苯的细菌,通过降解甲苯的速度和浓度进行复筛,挑选出了三株降解效率比较高的菌,对其进行分离和鉴定,并研究各种不同的条件对菌株降解甲苯能力的影响。且对降解甲苯有关的基因进行了克隆,构建了邻苯二酚2,3-双加氧酶的表达菌株,将其纯化后对其酶学性质进行了初步研究。本文主要进行了以下方面的研究:1)从化工厂排污口分离到了七株能降解甲苯的菌株,其中有三株菌降解甲苯的能力更强,分别编号为L1、L2、L3。以细菌基因组为模板和16SrDNA通用引物进行PCR,将PCR产物测序后,通过Blast比对发现菌株L1、L3和芽孢杆菌属的相似性很高。进一步对菌株进行形态学鉴定和生理生化试验,推测L1为短芽孢杆菌,L3为梭形芽胞杆菌。2)比较降解甲苯的速度,其中L3菌株24h可以将433 mg/L的甲苯完全降解,而L1菌株48h还不能将433 mg/L的甲苯全部降解,L3的降解效果更好。因此,选L3作为高效甲苯降解菌进行后续的研究。通过对培养基pH,培养温度,菌种接入量和初始甲苯浓度的改变来研究理化因素对菌株降解甲苯能力的影响。实验结果显示,当温度为30℃,pH为8.0时降解效果最好。接种量和降解的速率呈正相关,接种量高于9%时由于接种量已经达到饱和对降解速率影响不大。L3可以将浓度为433 mg/L的甲苯很快降解掉,但当甲苯浓度在541.25 mg/L以上时降解速度就变得非常缓慢,30 h时,L3可以将浓度为541.25 mg/L的甲苯降解93.87%,将浓度为649.5 mg/L的甲苯降解80.49%。3)对降解甲苯的相关基因进行了克隆,利用pET23a构建了邻苯二酚2,3-双加氧酶(C230)的表达载体。重组蛋白通过His-tag进行纯化,纯化出的产物蛋白浓度为8.3 mg/mL。对纯化的C230进行酶学性质的研究,发现酶的热稳定性一般,其最适温度是30℃。酶在碱性条件下稳定性比酸性条件下高,最适pH值为8.0。Mg2+和Fe2+对酶活有明显提高;Cu2+会使酶活性降低;Ca2+和Fe3+基本不影响酶活。EDTA作为金属离子螯合剂,对酶活性影响不大。酶在4℃条件下,保存效果最好。