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糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式,对蛋白质的结构和功能有着重要影响。本文以黑曲霉单宁酶为研究对象,对单宁酶进行分离纯化;研究该单宁酶的酶学性质及催化反应动力学;分析探讨糖基化对该单宁酶的热稳定性及构象稳定性的影响。主要研究结果如下:(1)采用硫酸按分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析及SephadexG-150凝胶柱层析三步分离纯化后,得到电泳纯度的单宁酶,其比酶活为150.63 U/mg,纯化倍数为20.92,酶活回收率为35.95%。经SDS-PAGE电泳显示该单宁酶由两个亚基组成,分子量分别为45.0 kDa和36.9 kDa,单宁酶总分子量为81.9 kDa。(2)纯化后的单宁酶其最适反应pH值和温度为5.0和50 ℃,热稳定性范围和pH值稳定性范围为20-60 ℃和4.0-6.5,且pH值及温度均对单宁酶的二级结构有影响。4 ℃下储存稳定性表现为单宁酶粗酶液比纯化后的单宁酶更稳定,存储周期更长,可能因为粗酶液中有某些物质对单宁酶酶活起到保护作用。分析研究一些添加剂对单宁酶活性的影响,结果显示Sn2+、Hg2+、Al3+、Fe2+、Fe3+及Cu2+对单宁酶的活性抑制作用,且随着金属离子浓度的增加;Mg2+、Mn2+、Ca2+、Ba2+及Zn2+对单宁酶活性有一定的促进作用,而Na+、K+及Li+对单宁酶活性的影响较小。表面活性剂(吐温20、吐温60、吐温80、曲拉通X-100)及抑制剂(EDTA、SDS)对单宁酶的活性均有抑制作用,且均随着作用时间的延长抑制作用增强。有机试剂乙醇、丙醇、丙酮、四氯化碳、甲醛、石油醚对单宁酶的活性均有抑制作用,且随着有机试剂的浓度的增大和作用时间的延长,其抑制效果增强,其中丙酮的抑制作用最强。以没食子酸丙酯为反应底物时,单宁酶的Km=9.03 mmol/L,Vmax=0.10 mmol/min。随着温度的升高,单宁酶的kd和△Gd增大,而Ea,d、△Hd、ASd、t1/2减小,说明随着温度升高,单宁酶稳定性越差。(3)单宁酶的去N-糖基化优化条件为:PNGaseF用量0.5%(v/v),在37 ℃下酶切12 h。用PNGase F对单宁酶进行酶解后,单宁酶的两个亚基变成45.0 kDa和29.1 kDa。去N-糖基化后单宁酶的活性损失了 34.42%,其热稳定性也有所下降。圆二色谱、荧光色谱及原子力显微镜结果显示,单宁酶经过PNGase F去N-糖基化处理及热处理后,其二级结构、三级结构和微观形态均发生不同程度变化,说明该单宁酶分子经过去N-糖基化后,分子内可能发生重排,分子结构发生变化,并导致酶活性下降。