目的:探讨mi R-143-3p及其靶基因蛋白在调控人骨肉瘤(OS)细胞生物学行为及肺转移中的分子机制,为开发mi RNA再表达技术靶向抑制OS肺转移提供新的理论依据。方法:(1)RT-PCR检测OS细胞株MG63和HOS细胞中mi R-143-3p、mi R-411-5p和mi R-195-5p表达的不同。用上述三种mi RNA成熟体(mimics,M)分别转染OS细胞株MG63和HOS细胞,通过MTT、划痕、Transwell等实验检测mi RNA对OS增殖、转移和侵袭能力的影响。(2)激光粒度仪测定不同浓度mi RNA mimics/CS纳米球悬液的平均粒径;将不同浓度MNC/CS纳米球悬液注射入裸鼠尾静脉,或者将2mg/ml MNC/CS纳米球悬液注射到裸鼠尾静脉,于不同时间点处死裸鼠。活体成像仪观察裸鼠肺部蓄积的荧光强度,显示mi RNA mimics/CS纳米球悬液的肺靶向性。(3)将OS细胞株原位种植到裸鼠胫骨骨髓腔内,统计OS肺转移模型成瘤率,HE染色检测肺转移情况。将裸鼠OS肺转移模型分为两组(对照组和实验组),分别尾静脉注射阴性对照mimics/CS纳米球悬液和mi R-143-3p mimics/CS纳米球悬液,持续给药4周后,采用体积测量初步测定OS增殖的影响,HE染色检测裸鼠肺转移情况。(4)使用Target Scan 6.1,Diana micro T4.0和MICRORNA.ORG生物信息软件分析筛选与肺转移相关的mi R-143-3p靶基因(ITGA6、ASAP3、CRELD1和MSI2)。将mi R-143-3p M转染HOS细胞,提取蛋白,通过Western blot检测mi R-143-3p靶基因蛋白表达水平。分别将对照组(MNC)与实验组(mi R-143-3p/CS)裸鼠新鲜肺脏组织匀浆,并提蛋白,采用Western blot检测mi R-143-3p靶蛋白的表达水平。结果:(1)RT-PCR结果显示,在MG63和HOS细胞中mi R-143-3p表达量均显著下降。MTT结果显示mi R-143-3p对增殖无影响,划痕实验结果显示mi R-143-3p抑制OS细胞株的转移能力,Transwell结果显示mi R-143-3p抑制OS细胞株的侵袭能力。(2)激光粒度仪和活体成像仪结果显示肺内蓄积荧光最显著的MNC/CS纳米球悬液浓度为2mg/ml,粒径大小为336.9nm,具有肺靶向性。(3)HOS细胞原位种植5周后所有裸鼠左侧胫骨接种处出现局部隆起及肿胀,肺脏未出现转移灶;种植6周起所有裸鼠左侧胫骨接种处出现肿块,原位成瘤率为100%,且肺脏均出现转移灶。MG63细胞原位种植裸鼠至实验结束仍未出现瘤块及转移灶。给药结束时,与MNC组裸鼠相比,M组裸鼠明显跛行,且两组原位瘤块平均体积无明显差异;HE染色结果显示,MNC组均有肺转移灶,M组大部分无肺转移灶,有1只裸鼠存在肺转移灶。(4)生物信息学预测出mi R-143-3p靶基因,发现与肺转移相关的靶基因有4个,分别为ASAP3、ITGA6、MSI2和CRELD1。Western blot结果显示,HOS细胞中的ASAP3与MSI2蛋白表达显著降低,ITGA6和CRELD1无变化。对照组和实验组肺组织中的ASAP3与MSI2蛋白表达显著降低,ITGA6和CRELD1无变化。结论:(1)通过RT-PCR、MTT、划痕和Transwell实验成功筛选出低表达mi R-143-3p。结果表明mi R-143-3p抑制OS细胞株侵袭和转移的作用,但对增殖无影响。(2)激光粒度仪和活体成像仪成功筛选出肺内蓄积荧光最显著的MNC/CS纳米球悬液浓度为2mg/ml,粒径大小为336.9nm,具有肺靶向性,可用于体内实验尾静脉注射药物时的载体。(3)体内实验验证mi R-143-3p mimics/CS纳米球悬液抑制OS肺转移,表明mi R-143-3p具有抑制OS肺转移的作用。(4)生物信息学筛选出肺转移相关靶基因,通过Western blot方法,揭示了mi R-143-3p的增加导致了靶蛋白ASAP3和MSI2在体内外的减少,而ITGA6和CRELD1无变化。