灵芝（Ganoderma lucidum）是一种被广泛种植的食药用真菌,含有多种具有药理学功能的活性成分。随着灵芝全基因组序列测序的完成和遗传转化体系的构建,为研究灵芝次级代谢和菌丝生长提供了夯实的基础。血红素加氧酶（heme oxygenase,HO）,将血红素分解成胆绿素（biliverdin,BV）,并释放出一分子的一氧化碳（carbonmonoxide,CO）和一分子的Fe2+。血红素加氧酶在真核生物中广泛存在,在多种细胞进程中均发挥作用。本研究首次从灵芝中克隆出血红素加氧酶基因,并发现其参与菌丝生长、多糖合成、热胁迫响应以及灵芝三萜（又名灵芝酸,ganoderic acid,GA）合成的生理过程。首先,本研究在灵芝中克隆HMX1基因,HMX1的开放阅读框长度为1092 bp,编码363个氨基酸。随后对HMX1蛋白进行原核表达,测定纯化蛋白的酶活力。该蛋白的 Km 值为 0.699 μM,Vm 值为 81.9 nmol BV h-1 nmol-1 pro,最适 pH 为 7.2,最适温度为37℃。通过构建沉默载体pAN7-dual-HMX1,得到了沉默效率分别为91%和85%的转化子HMX1i1和HMX1i2。与野生型（wild type,WT）相比,HMX1i1和HMX1i2的菌丝平均增长速率分别降低31%和23%。与WT菌株菌丝生物量相比,HMX1i1和HMX1i2的菌丝生物量分别下降53%和48%。沉默HMX1基因,胞外多糖（extracellular polysaccharides,EPS）和胞内多糖（intracellular polysaccharides,IPS）也有不同程度的升高。与WT的胞外多糖含量相比,HMX1i1和HMX1i2分别提高59%和51%。与WT相比,HMX1i1和HMX1i2的胞内多糖分别增加24%和22%。本文还测定了多糖合成的四种关键酶基因的转录水平,分别是磷酸葡萄糖异构酶（phosphoglucose isomerase,PGI）、α-磷酸葡萄糖变位酶（α-phosphoglucomutase,PGM）、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-Glc pyrophosphorylase,UGP）和磷酸甘露糖异构酶（phosphomannose isomerase,PMI）,发现 PCI、UGP 和两个 PMI基因的表达水平显著提高,PGM的转录水平没有明显变化。这些结果表明,HMX1基因影响灵芝菌丝生长和多糖合成。然后,本研究检验了HMX1在不同胁迫下的转录水平,发现热激30 min条件下,HMX1转录水平变化最显著,而且在热胁迫下灵芝血红素加氧酶活性和一氧化碳含量都有显著的变化。在热胁迫下,沉默HMX1会抑制灵芝菌丝生长并且会增加GA的含量,而且外源改变血红素加氧酶活性确实能够影响GA的含量。在热胁迫下外源添加CO的供体和清除剂改变胞内CO含量后,GA的含量也会发生改变,但外源添加胆红素却对GA的合成没有显著的影响。为了进一步探究CO响应热胁迫和改变GA的机制,本研究发现热胁迫下,slt2和Hog1的活性会发生变化,HMX1沉默菌株中slt2活性的变化趋势与WT菌株不一致。因为slt2属于细胞壁完整性（cell wall integrity,CWI）途径中的一员,因此进一步检测发现沉默HMX1会降低对细胞壁胁迫敏感性。进而检测发现沉默HMX1,灵芝细胞壁成分几丁质和葡聚糖的含量显著升高,热胁迫下,几丁质和葡聚糖含量进一步升高。这些结果暗示HMX1/CO可能通过slt2影响细胞壁成分来响应热胁迫。综上所述,这些研究结果表明灵芝中HMX1/CO在影响菌丝生长,多糖合成,热胁迫响应以及GA合成中具有重要作用,为后续研究奠定了基础。