【摘 要】
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有害藻华（Harmful algal blooms,HABs）作为一种异常的生态现象,近年来其发生频率和危害程度明显上升,对生态环境、海洋经济以及人类健康造成了严重威胁。东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）作为一种有害微藻,在东海引发HABs的频率和规模均位居第一,为了减少该藻引起的HABs造成的经济损失,有必要建立快速有效的检测技术。近年来,试纸条检测技术由于具备简单、
【基金项目】
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山东省自然科学基金-海洋产毒微藻的多重三明治杂交-核酸层析芯片高通量快速定量分析技术项目；
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有害藻华（Harmful algal blooms,HABs）作为一种异常的生态现象,近年来其发生频率和危害程度明显上升,对生态环境、海洋经济以及人类健康造成了严重威胁。东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）作为一种有害微藻,在东海引发HABs的频率和规模均位居第一,为了减少该藻引起的HABs造成的经济损失,有必要建立快速有效的检测技术。近年来,试纸条检测技术由于具备简单、快速、成本低和肉眼可判断结果等优势已经得到了广泛的研究与应用。因此,本研究以东海原甲藻为目标藻种,建立了两种特异性的核酸层析试纸条检测技术,即聚合酶链式反应结合dot-核酸层析试纸条（Polymerase chain reaction integrated with dot nucleic acid chromatography strip,PCR-dNACS）和酶保护分析结合dot-核酸层析试纸条（Nuclease protection assay integrated with dot nucleic acid chromatography strip,NPA-dNACS）,以期为东海原甲藻的现场检测提供新方法。（1）首先提取东海原甲藻的基因组DNA,利用通用引物D1/D2扩增核糖体大亚基（Ribosomal large subunit DNA,LSU rDNA）序列。将扩增产物进行纯化回收、T-A克隆和测序,确定目标藻种的LSU序列,并以其为目标序列设计用于PCR-dNACS的引物FP-Tag1/RP-Tag2以及用于NPA-dNACS的探针NPAP、CP1/CP2。以凡纳滨对虾的肌动蛋白基因（Penaeus vannamei actin gene,Genebank入口号:LOC113819259）为靶区间,设计用于dNACS的三条探针,即纳米金颗粒标记探针GNPs-cTag1、检测探针cTag2和控制探针Tag1。（2）基于特异性设计的引物标签序列Tag1/Tag2和dNACS上的探针序列之间的互补杂交建立了PCR-dNACS检测技术。然后对PCR扩增体系进行了优化,确定的最佳扩增条件如下:退火温度62℃,引物浓度0.15μM,Mg2+浓度1.5 mM。接着对dNACS体系进行了优化,确定的GNPs-cTag1探针最优浓度为0.4μM,cTag2探针最优浓度为2.5μM。将经过优化的PCR体系与dNACS结合验证探针的特异性以及检测技术的灵敏度和稳定性。特异性实验结果表明探针对目标藻具有特异性,与其它控制微藻不发生反应。用目标藻基因组DNA和含有目标藻LSU序列的重组质粒DNA为模板分别进行灵敏度测试,结果表明PCR-dNACS的灵敏度比普通PCR高10倍。稳定性测试结果表明干扰藻不会对目标藻的检测结果产生影响。此外,应用PCR-dNACS对含有目标藻的模拟自然水样进行检测,结果显示该技术的细胞检测限为1.27×10~1 cells mL-1。（3）为简化实验步骤和降低对大型仪器的依赖,本研究在PCR-dNACS的基础上,又建立了NPA-dNACS检测技术。首先以东海原甲藻LSU为目标序列设计特异性酶保护分析探针（Nuclease protection assay probe,NPAP）和捕获探针（Capture probe,CP）CP1/CP2,通过与其他微藻进行特异性实验,确定了探针对目标藻的特异性。其次,对NPA过程中涉及到的NPAP与rRNA的杂交温度和杂交时间、对核酸杂交过程中涉及到的CP1/CP2的浓度以及NPAP与CP1/CP2的杂交时间和杂交温度分别进行了优化,系统建立了NPA-dNACS检测体系。另外,通过梯度稀释的RNA作为分析样品评估NPA-dNACS的灵敏度,结果显示,NPA-dNACS对目标藻RNA的检测限是0.70 ng。最后通过模拟自然水样测试对NPA-dNACS的实用性进行验证,结果表明该技术可以满足东海原甲藻HABs的预警检测需求。
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