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牛呼吸系统疾病(Bovine respiratory disease，BRD)是全世界牛生产中的一种主要流行疾病。BRD对牛的健康和生产性能具有深远影响，给畜牧养殖业带来严重的经济损失。BRD病因极其复杂，不良环境、支原体、病毒和细菌都可能导致牛发病。其中细菌性病原体，化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes, T.pyogenes)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, P. multocida)、溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica, M. haemolytica)和睡眠嗜组织菌(Histophilussomni, H. somni)通常被认为是引起BRD的主要病原菌。这些病原菌通常采用抗生素治疗，但近年来随着抗生素压力的持续存在，上述病原菌已经对常用药物产生了耐药性，对其引发疾病的治疗造成了困难，为此，针对牛呼吸系统疾病主要病原菌，筛选兽医专用的新型抗菌药物迫在眉睫。本研究从健康牛鼻拭子样品中分离到一株对BRD主要病原菌(多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、化脓隐秘杆菌)具有较强拮抗作用的菌株-木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus, S.xylosus)D3。对其胞外分泌蛋白D3-P进行逐级纯化，纯化产物对多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、化脓隐秘杆菌展现出良好的抗菌活性，MIC值分别为32μg/mL、64μg/mL、128μg/mL。通过LC-MS/MS分析，鉴定D3-P为一种含有LysM肽聚糖结合域的蛋白。以D3-P为研究对象，采用DNA凝胶电泳、SDS-PAGE、扫描电镜、透射电镜、转录组测序等手段，分析D3-P对3种牛呼吸系统疾病主要病原菌的DNA、蛋白质合成、细胞膜及细胞壁的影响，对其杀菌机制进行探索，主要研究内容如下：
1.拮抗菌株的筛选及D3全基因组测序分析
从吉林省不同地区采集的牛鼻拭子样本中共分离得到350株细菌，以牛源化脓隐秘杆菌、多杀性巴氏杆菌与溶血性曼氏杆菌为指示菌株，成功筛选出一株同时对3种指示菌具有良好拮抗作用的菌株-木糖葡萄球菌D3。对D3进行了全基因组测序分析，测得684,817,465bp原始数据，进一步过滤接头，短片段及低质量数据后，共得到662,639,659bpCleanData。组装得到完整基因组总长2.98Mb，包含1个染色体DNA，1个质粒DNA，共2,808个编码基因，基因平均长度891bp。非编码RNA预测结果显示，D3包括22个rRNA，59个tRNA，49个ncRNA。对所有预测到的蛋白序列进行分析，共预测到110个含有信号肽的蛋白，738个跨膜蛋白，74个分泌蛋白。
2.抗菌蛋白D3-P的分离、纯化与鉴定
采用硫酸铵盐析、超滤纯化与葡聚糖凝胶层析纯化等方法对木糖葡萄球菌D3发酵上清液中的抗菌蛋白进行逐级纯化，纯化后的抗菌蛋白对3种病原菌的抑菌圈直径高达27-28mm。SDS-PAGE结果经灰度扫描分析，经纯化得到的抗菌蛋白D3-P纯度大于96.5%。D3-P具有良好的热稳定性，酸碱稳定性，对蛋白酶K与木瓜蛋白酶稳定性差。通过Native-PAGE与LC-MS/MS进行联合分析，确定D3-P为含有LysM肽聚糖结合域的蛋白。抗菌蛋白D3-P共有435个氨基酸，理论分子质量为48,364.06Da，分子式为C2133H3358N594O678S6,且具有良好的亲水性。D3-P的信号肽剪切位点在24与25位点间，在D3-P蛋白序列末端匹配到3个LysM基序。以自溶素(4knk.1.A)为模板成功的进行了同源建模，D3-P的三维结构模型含有一个Zn2+配体。
3.抗菌蛋白D3-P杀菌机制的初步研究
分别对牛呼吸系统疾病主要病原菌进行MIC测定，D3-P对多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌与化脓隐秘杆菌MIC值分别为32μg/mL，64μg/mL与128μg/mL。抗菌蛋白D3-P对3种病原菌具有高效的杀菌活性，菌体数量在加入抗菌蛋白D3-P后成指数下降。在抗菌蛋白D3-P作用下，与对照组相比，3种病原菌菌体内ATP含量显著下降，而ROS含量显著升高。通过DNA结合试验证明了D3-P主要作用靶点不是基因组DNA。经SDS-PAGE分析，D3-P也不影响菌体蛋白质的合成。利用扫描电镜与透射电镜观察抗菌蛋白D3-P作用后菌体超微结构变化，并结合LC-MS/MS分析结果，可以推测D3-P是通过裂解菌体细胞壁肽聚糖构架中的L-丙氨酸和N-乙酰胞壁酸之间酰胺键对细菌产生杀伤作用。
4.抗菌蛋白D3-P对3种病原菌作用的转录组学分析
三种病原菌在抗菌蛋白D3-P终浓度为1/2×MIC的条件下作用1小时：多杀性巴氏杆菌组共有67个显著差异表达基因，其中细胞分裂相关基因zapB显著下调，抗菌蛋白D3-P影响菌体的细胞分裂与细胞形态调节等生物学过程；溶血性曼氏杆菌组共有78个显著差异表达基因，recN与ftsN的表达显著下调，抗菌蛋白D3-P对菌体细胞细胞壁大分子的合成与代谢、细胞的分裂具有抑制作用；化脓隐秘杆菌组共有70个显著差异表达基因，amiD基因的表达受到抑制作用，抗菌蛋白D3-P影响菌体细胞细胞壁结构中肽聚糖的分解与代谢过程。此外，在抗菌蛋白D3-P的作用下，3种病原菌共同富集到了“ABC转运体”、“硫代谢”、“2-氧代羧酸代谢”与“氨基酸的生物合成”代谢通路。
1.拮抗菌株的筛选及D3全基因组测序分析
从吉林省不同地区采集的牛鼻拭子样本中共分离得到350株细菌，以牛源化脓隐秘杆菌、多杀性巴氏杆菌与溶血性曼氏杆菌为指示菌株，成功筛选出一株同时对3种指示菌具有良好拮抗作用的菌株-木糖葡萄球菌D3。对D3进行了全基因组测序分析，测得684,817,465bp原始数据，进一步过滤接头，短片段及低质量数据后，共得到662,639,659bpCleanData。组装得到完整基因组总长2.98Mb，包含1个染色体DNA，1个质粒DNA，共2,808个编码基因，基因平均长度891bp。非编码RNA预测结果显示，D3包括22个rRNA，59个tRNA，49个ncRNA。对所有预测到的蛋白序列进行分析，共预测到110个含有信号肽的蛋白，738个跨膜蛋白，74个分泌蛋白。
2.抗菌蛋白D3-P的分离、纯化与鉴定
采用硫酸铵盐析、超滤纯化与葡聚糖凝胶层析纯化等方法对木糖葡萄球菌D3发酵上清液中的抗菌蛋白进行逐级纯化，纯化后的抗菌蛋白对3种病原菌的抑菌圈直径高达27-28mm。SDS-PAGE结果经灰度扫描分析，经纯化得到的抗菌蛋白D3-P纯度大于96.5%。D3-P具有良好的热稳定性，酸碱稳定性，对蛋白酶K与木瓜蛋白酶稳定性差。通过Native-PAGE与LC-MS/MS进行联合分析，确定D3-P为含有LysM肽聚糖结合域的蛋白。抗菌蛋白D3-P共有435个氨基酸，理论分子质量为48,364.06Da，分子式为C2133H3358N594O678S6,且具有良好的亲水性。D3-P的信号肽剪切位点在24与25位点间，在D3-P蛋白序列末端匹配到3个LysM基序。以自溶素(4knk.1.A)为模板成功的进行了同源建模，D3-P的三维结构模型含有一个Zn2+配体。
3.抗菌蛋白D3-P杀菌机制的初步研究
分别对牛呼吸系统疾病主要病原菌进行MIC测定，D3-P对多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌与化脓隐秘杆菌MIC值分别为32μg/mL，64μg/mL与128μg/mL。抗菌蛋白D3-P对3种病原菌具有高效的杀菌活性，菌体数量在加入抗菌蛋白D3-P后成指数下降。在抗菌蛋白D3-P作用下，与对照组相比，3种病原菌菌体内ATP含量显著下降，而ROS含量显著升高。通过DNA结合试验证明了D3-P主要作用靶点不是基因组DNA。经SDS-PAGE分析，D3-P也不影响菌体蛋白质的合成。利用扫描电镜与透射电镜观察抗菌蛋白D3-P作用后菌体超微结构变化，并结合LC-MS/MS分析结果，可以推测D3-P是通过裂解菌体细胞壁肽聚糖构架中的L-丙氨酸和N-乙酰胞壁酸之间酰胺键对细菌产生杀伤作用。
4.抗菌蛋白D3-P对3种病原菌作用的转录组学分析
三种病原菌在抗菌蛋白D3-P终浓度为1/2×MIC的条件下作用1小时：多杀性巴氏杆菌组共有67个显著差异表达基因，其中细胞分裂相关基因zapB显著下调，抗菌蛋白D3-P影响菌体的细胞分裂与细胞形态调节等生物学过程；溶血性曼氏杆菌组共有78个显著差异表达基因，recN与ftsN的表达显著下调，抗菌蛋白D3-P对菌体细胞细胞壁大分子的合成与代谢、细胞的分裂具有抑制作用；化脓隐秘杆菌组共有70个显著差异表达基因，amiD基因的表达受到抑制作用，抗菌蛋白D3-P影响菌体细胞细胞壁结构中肽聚糖的分解与代谢过程。此外，在抗菌蛋白D3-P的作用下，3种病原菌共同富集到了“ABC转运体”、“硫代谢”、“2-氧代羧酸代谢”与“氨基酸的生物合成”代谢通路。