论文部分内容阅读
利用现代分子生物学手段对化合物的生物合成途径进行揭示和调控的方法可以解决因中药活性成分（或天然成分）在植物体内含量低、提取分离难度大,或因结构复杂造成化学合成困难等因素而造成的药用植物活性成分的开发利用困难的难题。利用基因重组技术来调控相关基因的表达水平或者构建生物工程菌来定向、大量的合成目标产物及其衍生物是目前天然产物研究热点。姜（Zingiber officinale Roscoe.）中含有姜黄素、姜辣素、黄酮、挥发油等成分。其中姜黄素类成分具有多种生物学活性,其生物合成涉及多种酶的参与。虽然姜黄中关于姜黄素生物合成的酶已有报道,是由姜黄素合酶（Curcumin synthase,CURS）和二聚酮合酶（diketide-CoA synthase,DCS）共同催化合成,但姜中参与此类化合物的生物合成途径的基因目前尚无明确报道。且在不同组织中克隆表达的CURS的表达量及其对底物的选择性也存在显著差异。吴茱萸（Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.）为常用中药,大量用于临床方剂和成方制剂的组方中,中药吴茱萸中存在大量的C-2位烷基取代的喹诺酮生物碱对其生物活性有重要影响,然而有关其生物合成途径在植物中尚无报道。瑞香科植物白木香（Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg）,遭受外界刺激如虫蚀、雷击、刀斧砍伤或真菌侵染等胁迫作用下在其伤口附近分泌生成具有特殊香味的树脂,含有该树脂的干燥木材称为沉香。沉香为名贵中药材之一,具有行气止痛,温中降逆,纳气平喘的功效。由于天然沉香的形成周期漫长、市场需求巨大而导致其频遭掠夺式开发,野生资源日渐稀缺。2-（2-苯乙基）色酮类成分为沉香的特征性成分,也是决定沉香品质的关键物质,其生物合成途径目前尚不明确。阐明2-（2-苯乙基）色酮类成分的生物合成机制,对于揭示沉香形成的生物学机制具有重要意义。本课题从参与三种药材的三种类型的活性成分的生物合成途径出发,试图挖掘出与其活性成分姜黄素、C-2位烷基取代的喹诺酮类生物碱以及2-（2-苯乙基）色酮类化合物生物合成密切相关的基因,整体了解这些具有生物活性的次生代谢产物的生物合成机制,为深入开展其合成生物学的研究奠定基础,为相关中药资源的可持续利用提供条件。基于以上认识,本论文结合EST文库筛选、转录组测序分析、Race扩增技术和基因重组技术,从姜、吴茱萸、白木香三种植物中获取了参与姜黄素、2-烷基取代喹诺酮生物碱以及2-（2-苯乙基）色酮生物合成途径的关键酶,并对其功能进行研究,取得以下成果:一、根据姜的EST文库和NCBI数据库,结合同源克隆和Race扩增技术,从姜中克隆分别得到一个二聚酮辅酶A合成酶（ZoDCS）、一个姜黄素合成酶（ZoCURS）、一个Ⅲ型聚酮合成酶（ZoPKS1）和一个双键还原酶（ZoReductase）,并对其催化功能进行了研究,证实ZoDCS、ZoCURS和ZoReductase均参与了姜中姜黄素类化合物及其类似物的生物合成,这也是首次阐释姜中姜黄素类化合物的生物合成途径。ZoDCS可以催化阿魏酰辅酶A和丙二酰辅酶A脱羧形成feruloyldiketide-CoA,产生的feruloyldiketide-CoA又与阿魏酰辅酶A在ZoCURS的催化作用下生成姜黄素。而从姜中克隆表达的ZoReductase可以专属性的还原姜黄素及其类似物庚烷母体结构中的双键生成庚烷母体双键还原的姜黄素类化合物。值得注意的是虽然从姜中克隆得到的ZoPKS与姜中克隆得到的姜黄素合酶的氨基酸序列高度同源,但却不能催化合成姜黄素,说明重要氨基酸位点的改变对酶催化功能具有重要影响。二、首次通过在二聚酮合酶（diketide-CoA synthase,DCS）和姜黄素合酶ZoCURS的开放式阅读框之间引入三个氨基酸（Gly-Ser-Gly）的连接接头,构建了 1个长2.349 kb,编码85.47 KD的非天然融合蛋白DCS::CURS,并实现了在大肠杆菌中的成功表达。DCS::CURS不仅保持了 DCS和CURS两步催化的活性,并且DCS::CURS的催化效率较两步催化合成姜黄素的效率更高,副产物苄基丙酮的合成量明显减少,这对于采用生物工程的方法生产姜黄素及其类似物具有非常重要的意义。三、在构建非天然融合蛋白DCS::CURS的基础上,成功在大肠杆菌中实现了包含乙酰辅酶A羧化酶（ACC）、4-羟基肉桂酸辅酶A连接酶（4CL）、非天然融合蛋白DCS::CURS多个酶的姜黄素生物合成途径的异源重构,实现了以山梨醇为碳源、阿魏酸及其类似物为底物合成姜黄素类成分的微生物合成体系。并通过大肠杆菌诱导表达体系和发酵条件的优化,使得目标化合物姜黄素的产量提高到386.8 mg/L,远高于以前文献报道。四、从中药吴茱萸中克隆表达两个新型喹诺酮合酶E.r QNS1、E.r QNS2。虽然E.r QNS1和E.r QNS2的氨基酸同源性很高,但其功能差异较大,E.r QNS1可以接受长链脂肪酸的β酮酸为底物生成C-2位烷基取代的喹诺酮类生物碱,而E.r QNS2只能催化生成简单的喹诺酮生物碱。此外,还克隆得到了两个聚酮合酶E.r CHS1、E.r CHS2,体外酶活性分析表明其为典型的查耳酮合酶,可以催化3分子的丙二酰辅酶A和对羟基肉桂酰辅酶A等起始底物缩合生成查耳酮类化合物。五、通过对沉香愈伤组织转录组数据的分析,发现其中存在大量的甲基转移酶基因,其中甲基转移酶A.s OMT1和A.s OMT2基因的表达水平在盐胁迫前后差异显著。因此,我们利用基因重组技术,从白木香愈伤组织中克隆并表达了两条甲基转移酶基因A.s OMT1和A.s OMT2,分别为744 bp、1212 bp,编码247、403个氨基酸,异源表达后获得分子量为28 KDa和44 KDa左右的重组蛋白。对二者的催化功能分析发现,这两个甲基转移酶都可以催化沉香中简单色酮上羟基的甲基化反应,且二者具有不同的甲基化位置选择性。A.s OMT1可以取代B环2’位上羟基的甲基化作用,A.s OMT2可以催化沉香2-（2-苯乙基）色酮A环上羟基的甲基化作用。此外,A.s OMT1和A.s OMT2还可以催化黄酮、黄酮苷、香豆素类化合物的甲基化反应,具有非常宽泛的底物选择性。