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针对乳品掺假的各种检测方法的研究是控制乳品品质的一个关键点，本课题针对牛乳中乳源蛋白，研究建立酶联免疫吸附(ELISA)检测技术。分别针对牛乳α-乳白蛋白(α-LA)和β-酪蛋白(β-CN)建立直接竞争法，及针对牛乳κ-酪蛋白(κ-CN)建立间接竞争法和间接法，通过检测牛乳中乳源蛋白含量来分析牛乳中掺假情况。
牛乳主要蛋白成分的分离制备：采用凝胶过滤色谱纯化得到浓度为0.319mg/mL的α-LA，得率为9.27％；基于β-及κ-CN等电点和对Ca2+敏感性的不同分离两种蛋白，分离得到浓度为0.629mg/mL和1.808mg/mL的牛乳β-和κ-CN，得率分别为2.10％和6.03％。
特异性IgG和IgY的制备与特性研究：以牛乳α-LA、β-及κ-CN分别免疫新西兰大白兔，收集高效价血清，采用饱和硫酸铵分步盐析和蛋白A亲和色谱纯化；用κ-CN免疫产蛋鸡，收集高免鸡蛋，采用水稀释、膜微滤超滤、盐析和亲和色谱纯化。得到纯化α-LA-IgG，β-CN-IgG，κ-CN-IgG及κ-CN-IgY样品。蛋白含量分别为：0.574mg/mL，0.5014mg/mL，0.5144mg/mL及0.3944mg/mL。经盐析纯化的IgG纯度达70％，经亲和色谱纯化的抗体IgG和IgY纯度高达90％。
牛乳蛋白抗原的酶标记技术研究：对抗原蛋白进行酶标记是建立直接竞争ELISA法的基础，选用辣根过氧化物酶(HRP)应用过碘酸钠氧化法对α-LA、β-及κ-CN分别进行标记，结果显示，HRP与α-LA的分子个数比为1.5:1，标记效果最佳（结合率22.2％，标记率66.7％）；β-CN的分子个数比为1:1时，标记效果最佳（结合率33.6％，标记率108.1％），所制得的酶标抗原的效价也较高均可达1:640。该法标记前两种抗原的酶结合率及标记率等指标较为合适，而κ-CN的酶标记物各指标均较低（酶结合率均低于2.2％，标记率最高为66.2％）。
牛乳蛋白检测的ELISA方法是课题的重点，实验了以下方法：
a、牛乳α-LA及β-CN抗原直接竞争ELISA法建立：确定了包被抗体最佳浓度（anti-α-LAIgG1:80及anti-β-CNIgG1:160）、封闭液体积及封闭时间（200μL，1％明胶，封闭1h）、酶标抗原稀释度（HRP-α-LA1:20及HRP-β-CN1:10）和待测牛乳样品稀释度(1:10及1:40)、底物最佳反应时间(25min，37℃)等对竞争ELISA效果有重要影响的因素；
b、牛乳κ-CN抗原间接竞争ELISA法建立：确定了牛乳κ-CN抗原包被浓度为2.500μg/mL，4℃包被过夜，anti-κ-CN-IgG工作浓度为1:640（起始浓度为1mg/mL），原料乳待测样品稀释度为1:10240，抗体与待测样品板外反应时间为30min;
c、确定了应用anti-κ-CN-IgG及anti-κ-CN-IgY建立的间接ELISA免疫方法中，酶标羊抗兔IgG最佳稀释度为1:2000，酶标兔抗鸡IgG最佳稀释度为1:5000。κ-CN抗原包被浓度分别为1.563μg/mL,25.000μg/mL。anti-κ-CN-IgG及anti-κ-CN-IgY工作浓度均为1:10（起始浓度为1mg/mL），原料乳待测样品稀释度为1:3200；
经过重复性试验及敏感性试验表明，本课题建立的检测牛乳α-LA及β-CN的直接竞争ELISA法对三聚氰胺的最低检出限分别为5％及6％。建立的检测牛乳κ-CN的间接竞争ELISA法的对三聚氰胺最低检出限为5％。变异系数均小于5％。以上方法均具有简单快速的特点。