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背景:动脉粥样硬化是动脉硬化的血管病中最常见、最重要的一种疾病。在国内外均是一种严重危害人类健康的常见疾病,并随着生活条件的改善动脉粥样硬化性疾病日趋高发,呈年轻化发展趋势。自从1904年德国莱比锡病理学家Marchand首次提出动脉粥样硬化一词以来,学者就一直在探索动脉粥样硬化的发病机制,可以肯定的是血管平滑肌细胞在动脉粥样硬化的发生发展中占据着重要地位。随着干细胞这门新兴学科的发展,使得在这古老的疾病认识上有了新的补充。在这个背景下本实验结合干细胞技术和基因调控技术做出探索。 目的:构建myocardin特异性shRNA(short hairpin RNA)真核表达载体,体外观察其对myocardin基因的沉默效应及对小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)向平滑肌样细胞分化过程中的影响。 方法:分离并培养小鼠骨髓间充质干细胞;利用血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF-BB)联合高浓度胎牛血清(20％FBS)诱导小鼠骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化;构建含u6启动子和myocardin特异性短发卡RNA(shRNA)编码序列的真核表达载体pGen-myo-shRNA为干扰质粒以及含非特异性shRNA编码序列的质粒载体pGenesil-Con(pCon)为阴性对照质粒。将诱导培养8天后的间充质干细胞分做以下三个实验组:一是空白对照组,只加入转染试剂 Lipofectamine2000;二是阴性对照组,加入转染试剂Lipofectamine2000和阴性对照质粒(pCon);三是干扰组,加入转染试剂和pGen-myo-shRNA干扰质粒。分别于转染48h后用RT-PCR技术检测细胞内myocardin mRNA表达的变化;同时用免疫组化方法检测细胞平滑肌肌球蛋白重链(SM myosin heavy chain, SM-MHC)的表达及结合细胞形态学改变来鉴定平滑肌样细胞的分化。 结果:经过测序鉴定,成功地构建了myocardin特异性 shRNA真核表达载体pGen-myo-shRNA。并且pGen-myo-shRNA干扰质粒体外成功转染小鼠间充质干细胞后,RT-PCR结果显示:干扰组细胞(0.411±0.013)较空白对照组(0.719±0.017) myocardin mRNA表达下调42.86%,其差异有显著统计学意义(P﹤0.05),阴性对照组细胞较空白对照组而言表达无明显变化,差异无统计学意义(P﹥0.05);同时免疫组化结果也表明:干扰组细胞 SM-MHC阳性表达水平(195.73±5.08)低于空白对照组(171.37±6.52),差异有统计学意义(P﹤0.05),阴性对照组和空白对照组之间无明显差异,差异无统计学意义(P﹥0.05)。 结论:小鼠骨髓间充质干细胞在PDGF-BB及高浓度胎牛血清诱导培养下可表达平滑肌细胞晚期标志基因SM-MHC和发生近似平滑肌细胞的形态学改变,说明小鼠骨髓间充质干细胞具有向平滑肌样细胞分化的潜能;构建的pGen-myo-shRNA重组质粒在mRNA水平能有效抑制myocardin基因的表达,且可使诱导培养8天后的小鼠骨髓间充质干细胞SM-MHC阳性表达下降,说明pGen-myo-shRNA干扰质粒对小鼠骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化有抑制作用;也表明myocardin在小鼠骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化过程中起重要作用。